Habarlar

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Ulanylýan brauzer wersiýaňyzyň çäkli CSS goldawy bar.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript bolmazdan hödürläris.
Aktiwleşdirilen efirlere ýa-da fenoksi radikallara esaslanýan ferment ýakynlygy bellik usullary janly öýjüklerdäki öýjükli beloklary we belok interaktorlaryny kartalaşdyrmak üçin giňden ulanylýar.Şeýle-de bolsa, işjeňleşdirilen efirler az reaktiw bolýar, netijede giň bellik radiusy bolýar we peroksid bejergisinden emele gelen fenoksi radikallar redoks ýollaryna päsgel berip biler.Bu ýerde miniSOG fotosensilizator belogyny gyzyklanma belogy bilen genetiki taýdan baglanyşdyrmak arkaly döredilen garaşly fotoaktiwasiýa (PDPL) usulyny bellik edýäris.Mawy yşyk bilen herekete getirilen we täsir ediş wagty bilen dolandyrylýan ýeke kislorod emele gelýär we anilin zondy bilen histidiniň galyndylarynyň spatiotemporal çözülişine ýetilýär.Organelle mahsus proteome kartasy arkaly ýokary wepalylygyny görkezýäris.PDPL-ni TurboID bilen gapma-garşy deňeşdirmek PDPL-iň has anyk we giňişleýin proteomiki gurşawyny görkezýär.Ondan soň, kesel bilen baglanyşykly transkripsiýa koaktiwator BRD4 we E3 Parkin ligasyna PDPL ulandyk we ozal näbelli interaktorlary tapdyk.Artykmaç barlag arkaly Parkin üçin iki sany näbelli substrat, Ssu72 we SNW1 kesgitlenildi, olaryň zaýalanmagy hemme ýerde-proteazoma ýoly bilen ara alnyp maslahatlaşylýar.
Belok torlarynyň takyk häsiýetlendirilmegi köp öýjükli amallaryň esasyny düzýär.Şonuň üçin beloklaryň özara täsiriniň ýokary takyk spatiotemporal kartasy biologiki ýollary, keselleriň patologiýasyny kesgitlemek we bejeriş maksatlary üçin bu täsirleri bozmak üçin molekulýar esas döreder.Bu maksat bilen janly öýjüklerde ýa-da dokumalarda wagtlaýyn täsirleri kesgitlemäge ukyply usullar gaty islenýär.Affinity Arassalaýyş köpçülik spektrometri (AP-MS) taryhda gyzyklanma beloklarynyň (POI) hökmany hyzmatdaşlaryny kesgitlemek üçin ulanylýar.San taýdan proteomika usullarynyň ösmegi bilen, AP-MS esasly belok torlarynyň iň uly maglumat bazasy bolan Bioplex3.0 döredildi.AP-MS gaty güýçli bolsa-da, öýjük lizisi we iş prosesinde eritme ädimleri gowşak we wagtlaýyn baglanyşdyryjy täsirlere tarap ugur alýar we lizden ozal birleşme ýok ýalňyş sözler ýaly lizden soňky artefaktlary hödürleýär.
Bu meseleleri çözmek üçin biri-birine bagly toparlar bilen tebigy däl aminokislotalar (UAA) we golaýdaky bellikli (PL) platformalary (mysal üçin APEX we BioID) 5 döredildi.UAA usuly köp ssenariýada üstünlikli ulanylsa we göni belok ýelimleri barada maglumat berýän bolsa-da, UAA goýulýan ýerini optimizirlemek zerur.Has möhümi, bellik hadysalarynyň katalitik tersligi bolmadyk stoiometrik bellik usulydyr.Munuň tersine, BioID usuly ýaly ferment PL usullary, in engineenerli biotin ligasyny POI7 bilen birleşdirýär, soň bolsa reaktiw biotinil-AMP ester aralygyny emele getirmek üçin biotini işjeňleşdirýär.Ferment şeýlelik bilen proksimal lizin galyndylaryny bellik edýän işjeňleşdirilen biotini “bulut” katalizleýär we çykarýar.Şeýle-de bolsa, BioID wagtlaýyn bellik bilen ulanylmagyny gadagan edýän ýeterlik bellikli signal almak üçin 12 sagatdan gowrak wagt talap edýär.Hamyrmaýa displeýine esaslanýan gönükdirilen ewolýusiýany ulanyp, TurboID BioID-iň has täsirli bolmagy üçin döredildi, 10 minutyň içinde biotin bilen netijeli bellik edilmegine mümkinçilik döredýär we has dinamiki prosesleriň öwrenilmegine mümkinçilik berýär.TurboID ýokary derejede işjeň we pes derejeli bellikler üçin endogen biotiniň derejesi ýeterlik bolany üçin, ekzogen biotiniň goşulmagy bilen ýokary derejede güýçlendirilen we wagtlaýyn bellik edilmegi talap edilende, fon belgilemesi potensial meselä öwrülýär.Mundan başga-da, işjeňleşdirilen efirler pes reaktiwdir (t1 / 2 ~ 5 min), bu uly bellik radiusyna sebäp bolup biler, esasanam goňşy beloklary biotin bilen doýandan soň. Başga bir usul bilen, in engineenerli askorbat peroksidazyň genetiki birleşmesi (ýagny biotin- fenol radikallary we bir minutyň içinde belok belgilemegine mümkinçilik berýär9,10. APEX öýjükli beloklary, membrananyň belok toplumlaryny we sitosoliki signal beriji belok toplumlaryny kesgitlemek üçin giňden ulanylýar11,12. Peröne, peroksidleriň ýokary konsentrasiýasynyň zerurlygy redoks beloklaryna ýa-da ýollaryna täsir edip biler. öýjükli amallar.
Şeýlelik bilen, öýjükli ýollary ep-esli bozmazdan ýokary giňişlik we wagtlaýyn takyklygy bilen has reaktiw bellikli radius basyş görnüşlerini döretmäge ukyply täze usul, bar bolan usullara möhüm goşundy bolar. Reaktiw görnüşleriň arasynda ýekeje kislorod gysga ömri we çäkli diffuziýa radiusy (öýjüklerde t1 / 2 <0,6 µs) sebäpli ünsümizi çekdi. Reaktiw görnüşleriň arasynda ýekeje kislorod gysga ömri we çäkli diffuziýa radiusy (öýjüklerde t1 / 2 <0,6 µs) sebäpli ünsümizi çekdi. С адан активных формасы наше внимание привлек синглетный Кидод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чидуса дифузии (t1 / 2 <0,6 мсек в клетках) 13. Işjeň görnüşleriň arasynda ýekeje kislorod gysga ömri we çäkli diffuziýa radiusy (öýjüklerde t1 / 2 <0,6 µs) sebäpli ünsümizi çekdi.在 活性 物质 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1/2 <0.6 µs） 而 引起 注意 注意 注意 13 Сәм активных форм наше внимание привлекает синглетный Кизод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чидуса дифузуии (t1 / 2 <0,6 мк в клетках). Işjeň görnüşleriň arasynda ýekeje kislorod gysga ömri we çäkli diffuziýa radiusy (öýjüklerde t1 / 2 <0,6 μs) sebäpli ünsümizi özüne çekýär.Singleeke kislorodyň metionini, tirozini, histidini we triptofany tötänleýin oksidländigi, amin ýa-da tiol esasly problara birikdirilmegi üçin 14,15 polýar bolandygy habar berildi.Öýjükli bölüm RNK-ny bellemek üçin ýekeje kislorod ulanylsa-da, endogen POI ýakynlyk belliklerini gaýtadan kesgitlemek strategiýalary öwrenilmän galýar.Bu ýerde, fotoaktiwasiýa bagly ýakynlyk belligi (PDPL) atly platforma hödürleýäris, bu ýerde miniSOG fotosensilizator bilen birleşdirilen POI-leri ýagtylandyrmak we proksimal galyndylary oksidlemek üçin ýeke kislorod öndürmek, soň bolsa himiki zondlary oksidlemek üçin amin öz içine alýan üýtgeşmeler bar. aralyk ýaşaýyş öýjükleri..Bellik aýratynlygyny ýokarlandyrmak üçin himiki gözlegleriň toparyny synagdan geçirdik we açyk proteomika iş akymyny ulanyp üýtgetme ýerlerini kesgitledik.PDPL-ni TurboID bilen gapma-garşy deňeşdirmek PDPL-iň has anyk we giňişleýin proteomiki gurşawyny görkezýär.Bu çemeleşmäni, öýjükli proteomyň organelle aýratyn belliklerine we düwnük keseli bilen baglanyşykly epigenetiki kadalaşdyryjy belok BRD4 we Parkinson keseli bilen baglanyşykly E3 ligasy Parkin üçin hökmany hyzmatdaşlary kesgitlemek üçin ulanýardyk, bu hem belli we näbelli belok ulgamyny tassyklady. özara täsirleri..PDPL-iň uly belok toplumlarynda E3 substratlaryny tanamak ukyby gytaklaýyn baglaýjylaryň ykrar edilmeginiň zerur ýagdaýyny görkezýär.Iqhli ýerde hemme ýerde proteazoma bilen araçylyk edilen näbelli parkin substratlary tassyklandy.
Fotodinamiki terapiýa (PDT) 19 we hromofor goldawly lazer inaktiwasiýasy (CALI) 20, fotosensilizatorlar bilen ýagty şöhlelenme ýeke kislorod döredýär, maksatly beloklary hereketsizleşdirip ýa-da öýjük ölümine sebäp bolup biler.Singleeke kislorod teoretiki diffuziýa aralygy takmynan 70 nm bolan ýokary reaktiw madda bolansoň, fotosensilizatoryň töwereginde giňişleýin çäklendirilen okislenmä gözegçilik edip bolýar.Bu düşünjä esaslanyp, janly öýjüklerde belok toplumlarynyň ýakyn bellik edilmegini gazanmak üçin ýeke kislorod ulanmagy makul bildik.Dört funksiýany ýerine ýetirmek üçin PDPL himoproteomiki çemeleşmäni taýýarladyk: (1) PL ferment çemeleşmesine meňzeş işjeň ýeke kislorodyň döremegini katalizlemek;(2) ýagtylygyň başlamagy bilen wagt çözülen bellikleri üpjün etmek;.
Fotosensilizatorlary kiçi molekulýar agramly floroforlary (mysal üçin gül bengal, metilen gök) 22 we genetiki taýdan kodlanan kiçi beloklary (mysal üçin miniSOG, KillerRed) iki topara bölmek bolar.Modully dizaýny gazanmak üçin POI24,25-e fotosensilizator (PS) beloklaryny goşup, ilkinji nesil PDPL platformasyny döretdik (1a surat).Mawy yşyk bilen şöhlelenende, ýekeje kislorod proksimal nukleofil aminokislotanyň galyndylaryny okislenýär, netijede elektrofil bolup, amin zondy nukleofiller bilen hasam täsir edip bilýän umpolung polýarlygy ýüze çykýar16,17.Synag, himiýa basmak we LC / MS / MS häsiýetnamasy üçin aşak düşmek üçin alkine tutawajy bilen işlenip düzüldi.
MiniSOG tarapyndan araçylyk edilen belok toplumlarynyň bellikleriniň shematiki şekili.Mawy ýagtylyga sezewar bolanda, miniSOG-POI aňladýan öýjükler özara täsir edýän beloklary üýtgedýän, ýöne hökmany däl beloklary üýtgedýän ýeke kislorod döredýär.Fotooksidlenmäniň aralyk önümleri, kowalent goşundylary emele getirmek üçin amin himiki zondynyň röle bellikleri bilen saklanýar.Himiýa gözlegindäki alkinil topary, LC-MS / MS mukdary bilen çekmek arkaly baýlaşdyrmak üçin himiýa basmaga mümkinçilik berýär.b 1-4 amin zondlarynyň himiki gurluşy.c Mitokondrial lokallaşdyrylan miniSOG-töwekgelçilikli proteomiki markerleriň 1-4 zondlary we gel densitometri esasynda deňeşdirilen mukdary ulanyp, floresan gel derňewi.Himiki zondlaryň signal-fon gatnaşygy, gök çyrany hasaba almazdan ýa-da miniSOG aňlatmasyz HEK293T öýjüklerini ulanmak bilen otrisatel gözegçilik synaglaryndan peýdalanyp baha berildi.n = 2 biologiki taýdan garaşsyz nusga.Her nokat biologiki nusgany aňladýar.d c ýaly görkezilen PDPL komponentleriniň barlygynda ýa-da ýoklugynda optimallaşdyrylan zond 3 ulanyp, PDPL-ni wekilçilikli kesgitlemek we kesgitlemek.n = 3 biologiki taýdan garaşsyz nusga.Her nokat biologiki nusgany aňladýar.Merkez çyzyklary we pyçaklar orta we ± standart gyşarmany görkezýär.CBB: Coomassie Brilliant Mawy.e Uzak gyzyl Si-DMA tegmili bilen ýeke kislorodyň konfokal şekillendirişi.Tereziniň çyzgysy: 10 µm.Gel şekillendiriş we konokok synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen azyndan iki gezek özbaşdak gaýtalandy.
Ilki bilen HEK293T-de durnukly beýan edilen kämillik ýaşyna ýeten fotosensilizatorlar miniSOG26 we KillerRed23-iň proteiniň himiki gözleg hökmünde protearlamin belligini ara alyp maslahatlaşmak ukybyny barladyk (Goşmaça 1a surat).Gel floresan derňewi, proteome bellikleriniň miniSOG we gök yşyk şöhlelenmesi arkaly gazanylandygyny görkezdi, emma KillerRed bilen hiç hili bellik önümi görülmedi.Signal-fona bolan gatnaşygy gowulandyrmak üçin, anilini (1 we 3), propilamin (2) ýa-da benzilamin (4) öz ​​içine alýan himiki zondlaryň toplumyny synagdan geçirdik.HEK293T öýjükleriniň özlerinde gök çyra bilen deňeşdirilende has ýokary fon signalynyň bardygyny gördük, belki endogen riboflawin fotosensilizatory, flawin mononukleotid (FMN) 27 sebäpli. Aniline esaslanan himiki zondlar 1 we 3 has gowy aýratynlyk berdi, HEK293T mitokondriýada miniSOG-y durnukly beýan edip, 3-nji zond üçin signalyň 8 esse ýokarlanandygyny görkezýär, RNA-bellik usulynda ulanylýan CAP-seq bolsa 2 ~ 2- görkezýär. eplenýän signalyň ýokarlanmagy, ähtimal RNK bilen belogyň arasyndaky dürli reaktiwlik islegleri sebäpli (1-nji surat, c). Aniline esaslanan himiki zondlar 1 we 3 has gowy aýratynlyk berdi, HEK293T mitokondriýada miniSOG-y durnukly beýan edip, 3-nji zond üçin signalyň 8 esse ýokarlanandygyny görkezýär, RNA-bellik usulynda ulanylýan CAP-seq bolsa 2 ~ 2- görkezýär. eplenýän signalyň ýokarlanmagy, ähtimal RNK bilen belogyň arasyndaky dürli reaktiwlik islegleri sebäpli (1-nji surat, c).Aniline esaslanan himiki zondlar 1 we 3 has gowy aýratynlygy görkezdi: mitokondriýada miniSOG-ny durnukly aňladýan HEK293T, 3-nji zond üçin signalyň 8 esse ýokarlanandygyny görkezýär, 2-nji zond bolsa diňe CAP-seq RNA bellik usulynda ulanylýar. RNK bilen belogyň arasyndaky dürli reaktiwlik islegleri sebäpli ~ 2,5 esse signalyň ýokarlanmagyny görkezýär (1b surat, c).HK293T 表达 线粒体 中 表达 miniSOG ， 探针 3 的 增加 增加> 8 倍 ， 用于 用于 RNA 标记 AP CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5- 倍 信号 由于 由于 由于 RNA 和 蛋白质 之间 b b 1b ， c）。基于 苯胺 的 探针 1 和 3 具有 hek293t 在 粒 体 is minisog ， 探针 3 的 增加 增加> 8 倍 而 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 - 倍 信号 增加 由于 由于 RNAAniline esaslanýan himiki zondlar 1 we 3 has gowy aýratynlyga eýe, HEK293T mitokondriýada miniSOG-y durnukly beýan etdi we 3-nji zondyň signalda 8 esse köpelendigi, CAP-seq RNA bellikleme usuly üçin 2-nji gözlegiň bolsa bary-ýogy 2,5 esse ýokarlanandygy görkezildi.signalda, ähtimal RNK bilen belogyň arasyndaky dürli reaksiýa islegleri sebäpli (1-nji surat, c).Mundan başga-da, 3-nji zonanyň optimizasiýasyny tassyklaýan 3 izomer we gidrazin zondlary (5, 6, 7 zondlar) synag edildi (Goşmaça 1b surat, c).Şonuň ýaly-da, jeliň içindäki floresan derňewi beýleki optimallaşdyrylan synag parametrlerini ýüze çykardy: şöhlelenme tolkun uzynlygy (460 nm), himiki zondyň konsentrasiýasy (1 mM) we şöhlelenme wagty (20 min) (Goşmaça 2a - c).PDPL protokolynda haýsydyr bir komponentiň ýa-da ädimiň goýulmagy signalyň fonda ep-esli tersine öwrülmegine sebäp boldy (1-nji surat).Bellemeli zat, ýekeje kislorody öçürýän belli natriý azidiň ýa-da troloksyň barlygynda belok belgilemesi ep-esli azaldy.Singleeke kislorody durnuklaşdyrýan belli D2O-nyň bolmagy, bellik signalyny güýçlendirýär.Beýleki reaktiw kislorod görnüşleriniň belliklere goşandyny öwrenmek üçin degişlilikde 18, 29-da gidroksil we superoksid radikal ýuwujylary döretmek üçin mannitol we C witamini goşuldy, ýöne bellikleri azaldýan tapylmady.H2O2 goşulmagy, ýöne yşyklandyryş däl, bellik edilmedi (Goşmaça 3a surat).Si-DMA zondlary bilen floresan ýeke kislorod şekillendirişi HEK293T-miniSOG siminde ýekeje kislorodyň bardygyny tassyklady, ýöne asyl HEK293T siminde däl.Mundan başga-da, mitoSOX Red yşyklandyrylandan soň superoksid önümçiligini ýüze çykaryp bilmedi (1e surat we goşmaça 3b surat) 30. Bu maglumatlar ýeke kislorodyň soňraky proteomiki belliklere jogapkär esasy reaktiw kislorod görnüşidigini görkezýär.PDPL-iň sitotoksikligi gök ýagtylygyň şöhlelenmesini we himiki zondlary öz içine aldy we ep-esli sitotoksiklik bolmady (Goşmaça 4a surat).
Etiketleme mehanizmini öwrenmek we LC-MS / MS ulanyp, belok toplumlaryny proteomiki kesgitlemäge mümkinçilik bermek üçin ilki bilen haýsy aminokislotalaryň üýtgedilendigini we gözleg bellikleriniň delta massasyny kesgitlemeli.Metioniniň, histidiniň, triptofanyň we tiroziniň ýeke kislorod tarapyndan üýtgedilendigi habar berildi14,15.TOP-ABPP31 iş prosesini MSFragger32 esasly FragPipe hasaplaýyş platformasy tarapyndan üpjün edilen bitarap açyk gözleg bilen birleşdirýäris.Singleeke-täk kislorod üýtgedilenden we himiki gözleg belliklerinden soň, himiýa basyp bolýan birleşdirijini öz içine alýan biotini azaltmak belligi bilen ýerine ýetirildi, soň bolsa neýtrawidin uzaldyldy we tripsin siňdirildi.Üýtgedilen peptid, henizem rezine bagly, LC-MS / MS derňewi üçin fotoklewasiýa edildi (2a surat we goşmaça maglumatlar 1).Proteomda 50-den gowrak peptid kartasy (PSM) gabat gelýän köp sanly üýtgeşme bolup geçdi (2-nji surat).Geň zat, diňe histidiniň üýtgemegine syn etdik, belki oksidlenen histidiniň beýleki aminokislotalara garanyňda anilin zondlaryna has ýokary reaktiwligi sebäpli.Singleeke kislorod bilen histidiniň okislenmeginiň çap edilen mehanizmine görä, +229 Da teklip edilýän delta-massa gurluşy, iki okislenmeden soň 2-okso-histidin bilen 3-nji zondyň goşulmagyna gabat gelýär, +247 Da bolsa gidroliz önümidir +229 Da (goşmaça 5-nji surat).MS2 spektrine baha bermek, üýtgedilen bölek ionlaryny (y we b) kesgitlemegi goşmak bilen, y we b ionlarynyň köpüsini kesgitlemegiň ýokary ygtybarlylygyny görkezdi (2-nji surat).PDPL üýtgedilen histidinleriň ýerli yzygiderliliginiň kontekst seljermesi small 1 pozisiýada kiçi gidrofob galyndylary üçin ortaça sebäbini görkezdi (Goşmaça 4b surat).Ortaça bir belok üçin 1,4 histidin kesgitlenildi we bu markerleriň ýerleri çözülip bilinýän ýerüsti meýdan (SASA) we degişlilikde çözüjiniň elýeterliligi (RSA) derňewi bilen kesgitlenildi (Goşmaça 4c surat, d).
MSFragger bilen işleýän FragPipe hasaplaýyş platformasyny ulanyp, galyndy saýlamany öwrenmek üçin bitarap iş prosesi.Arassalaýjy baglanyşyklar, streptawidin rezininden üýtgedilen peptidleriň fotoklewasiýasyna rugsat bermek üçin Click himiýasynda ulanylýar.Köp üýtgeşmeleri we degişli galyndylary kesgitlemek üçin açyk gözleg başlandy.b Proteomda bolup geçýän üýtgeşmeleriň massasyny belläň.Peptid kartasy PSM.c 3-nji zond bilen üýtgedilen gistidin ýerleriniň MS2 spektral düşündirişi. Wekilçilikli mysal hökmünde üýtgedilen aminokislota 3-nji zond bilen kowalent reaksiýa +229.0938 Da goşuldy.d PDPL markerlerini barlamak üçin ulanylýan mutasiýa barlagy.PRDX3 (H155A, H225A) we PRDX1 (H10A, H81A, H169A) Baýdaga garşy kesgitlemek üçin ýabany görnüşli plazmidler bilen ýokaşdy.e Sintetiki peptid 3-nji zonanyň barlygynda arassalanan miniSOG bilen reaksiýa berildi we LC-MS spektrinde Δm +247 we +229 degişli önümler bellendi.f MiniSOG-6xHis-belligi we anti-6xHis antikor bilen modellenen in vitro belok-belok täsiri.Antibiotin (streptawidin-HRP) we siçana garşy Günbatar blot derňewi, ýagtylyga duçar bolýan wagtyna baglylykda 3-nji zond bilen bellik edilen miniSOG-6xHis / anti-6xHis antikor toplumlary.Aýry-aýry beloklar üçin bellikler degişli molekulýar agramda aňladylýar: LC antikor ýeňil zynjyry, HC antikor agyr zynjyry.Bu synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen azyndan iki gezek özbaşdak gaýtalandy.
Etiketleme sahypasynyň biohimiki barlagy üçin köpçülikleýin spektrometriýa bilen kesgitlenen PRDX3 we PRDX1 histidinden alanine üýtgedildi we transfeksiýa barlaglarynda ýabany görnüş bilen deňeşdirildi.PDPL netijeleri, mutasiýa etiketkanyň ep-esli azalandygyny görkezdi (2-nji surat).Bu aralykda, açyk gözlegde kesgitlenen peptid yzygiderliligi 3-nji zondyň we gök çyranyň barlygynda arassalanan miniSOG bilen sintez edildi we reaksiýa berildi, LC-MS tarapyndan ýüze çykarylanda +247 we +229 Da köpçülikleýin üýtgemegi bilen önüm öndürdi (Surat) 2e).).MiniSOG fotoaktiwasiýa jogap hökmünde proksimal beloklaryň vitro bilen bellik edilip bilinjekdigini ýa-da ýokdugyny barlamak üçin, miniSOG-6xHis belogy bilen vitro-da monoklonal antikoryň arasynda täsirleşip emeli ýakynlyk barlagyny taýýarladyk (2-nji surat).Bu derňewde, miniSOG bilen antikorlaryň agyr we ýeňil zynjyrlarynyň takmynan bellik edilmegine garaşýardyk.Aslynda, syçana garşy (anti-6xHis belgili antikoryň agyr we ýeňil zynjyrlaryny tanamak) we streptawidin Günbatar bölekleri agyr we ýeňil zynjyrlaryň güýçli biotinilýasiýasyny görkezdi.Xeri gelende aýtsak, 6xHis belligi we ýeňil we agyr zynjyrlaryň arasyndaky baglanyşyk sebäpli miniSOG awtobiotinilýasiýasyna üns berdik, bu lizin bilen 2-okso-histidiniň proksimal jogabynyň öň beýan edilen boşlugy bilen baglanyşykly bolup biler.Sözümiziň ahyrynda, PDPL histidini ýakynlyga baglylykda üýtgedýär diýen netijä gelýäris.
Indiki maksadymyz, situ belliklemegiň aýratynlygyny barlamak üçin öýjükli proteomy häsiýetlendirmekdi.Şonuň üçin ýadroda, mitohondrial matrisada ýa-da HEK293T öýjükleriniň daşky ER membranasynda miniSOG-y durnukly beýan etdik (3a surat).Geliň floresan derňewi üç sany öýjükli ýerde köp bellikli zolaklary we dürli bellik nagyşlaryny ýüze çykardy (3b surat).Floresan şekillendiriş derňewi PDPL-iň ýokary aýratynlygyny görkezdi (3-nji surat).PDPL iş prosesi, floresan mikroskopiýasy arkaly öýjükli proteomlary kesgitlemek üçin rodamin boýaglary bilen basmak reaksiýalary bilen ýerine ýetirildi we PDPL signallary PDPL-iň ýokary wepalylygyny tassyklaýan DAPI, mitokondrial yzarlaýjylar ýa-da ER yzarlaýjylary bilen birleşdirildi.Üç sany organelle ýerleşýän ýer üçin, PDPL-ni TurboID bilen awidin günbatar düwmesini ulanyp, gapma-garşy deňeşdirmek, PDPL-iň degişli dolandyryşlary bilen deňeşdirilende has bellik edilendigini görkezdi.PDPL şertlerinde has köp PDPL belgili beloklary görkezýän has bellikli zolaklar peýda boldy (Goşmaça 6a-d).
miniSOG-töwellaçylykly organelle aýratyn proteome bellikleriniň shematiki görnüşi.miniSOG mitokondrial matrisany birleşdirmek arkaly adam COX4 (mito-miniSOG) 23 aminokislotalary, birleşmek arkaly ýadrosy H2B (ýadro-miniSOG) we ER membranasynyň sitoplazmatiki tarapy arkaly Sec61β nyşana alýar (ER-miniSOG) ).Görkezişlere jel şekillendiriş, konokok şekillendiriş we köpçülik spektrometri degişlidir.b Üç sany organelle mahsus PDPL profiliniň şekilli gel şekilleri.CBB Coomassie Brilliant Mawy.c HEK293T öýjükleriniň şekilli konokok şekilleri, V5 (gyzyl) belgili antikor bilen ýüze çykarylan dürli öýjükli lokalizasiýa bilen miniSOG-y durnukly görkezýär.Öýjükli markerler mitokondriýa we ER (ýaşyl) üçin ulanylýar.PDPL iş akymy, Cy3-azide basmak himiýasyny ulanyp, kiçi öýjükli proteomlary tapmagy öz içine alýar.Tereziniň çyzgysy: 10 µm.d Dürli organellerde PDPL bellikli proteomlaryň wulkan bölekleri, bellik edilmedik mukdarda (n = 3 garaşsyz biologiki synag).Iki guýrukly Talyp synagy wulkan meýdançalarynda ulanyldy.Negativearamaz gözegçilik hökmünde HEK293T ýabany görnüşi ulanyldy. Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi tapawudy). Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi tapawudy). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интеншности ионов). Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> ion intensiwliginde 2 esse tapawut).<着 变化 变化 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异。。<着 变化 <<<<0.05 和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> ion güýjüniň 2 esse tapawudy).HEK293T-miniSOG üçin möhüm, ýöne HEK293T üçin möhüm däl beloklar ýaşyl reňkde görkezilýär.e Synaglardan proteomiki maglumatlar bazalarynyň aýratynlygynyň derňewi d.Her organelle (gyzyl we ýaşyl nokatlar) statistik taýdan möhüm beloklaryň umumy sany ýokarda bellendi.Gistogrammalar MitoCarta 3.0, GO derňewi we A. Ting we ş.m. esasynda organellerde lokallaşdyrylan beloklary görkezýär.adamlar.Mitokondriýa, ýadro we ER üçin aýratyn maglumatlar bazalary.Bu synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen azyndan iki gezek özbaşdak gaýtalandy.Çig maglumatlar çig mal faýllary görnüşinde berilýär.
Jel we şekillendiriş netijeleri bilen höweslendirilen, her bir organda kesgitlenen proteomy kesgitlemek üçin etiketkasyz mukdar ulanyldy (Goşmaça maglumatlar 2).Goragsyz HEK293T fon markerlerini aýyrmak üçin otrisatel gözegçilik hökmünde ulanyldy. Wulkan sýu plotetiniň derňewi ep-esli baýlaşdyrylan beloklary (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi), şeýle hem diňe miniSOG-aňlatma setirlerinde bar bolan ýeke-täk beloklary görkezdi (3d surat gyzyl we ýaşyl nokatlar). Wulkan sýu plotetiniň derňewi ep-esli baýlaşdyrylan beloklary (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi), şeýle hem diňe miniSOG-aňlatma setirlerinde bar bolan ýeke-täk beloklary görkezdi (3d surat gyzyl we ýaşyl nokatlar). Аназа чикака вулкана показал значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2-кратная интингность ионов), также одиночные белки, кот че присутствуют только в чалиях, рисе ры. Wulkan sýu plotetiniň derňewi ep-esli baýlaşdyrylan beloklary (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi), şeýle hem diňe miniSOG-aňlatma setirlerinde bar bolan ýeke beloklary görkezdi (3-nji surat, gyzyl we ýaşyl nokatlar).S 在于 在于 在于 在于 <0.05 <S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S SMin minisog is d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d 3 d Аназа чикаика вулкана вявил значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельнее белки, присутствующие только врезрезной чирии miniSOG (красные и зеленыечччя). Wulkan sýu plotetiniň derňewi ep-esli baýlaşdyrylan beloklary (p <0.05 we> 2x ion güýji), şeýle hem diňe miniSOG aňlatma setirinde bar bolan ýekeje beloklary ýüze çykardy (3-nji suratdaky gyzyl we ýaşyl nokatlar).Bu maglumatlary birleşdirip, degişlilikde 1364, 461 we 911 statistik taýdan möhüm ýadro, mitokondrial we ER daşky membranaly beloklary kesgitledik.Organelle-lokallaşdyrylan PDPL-iň takyklygyny seljermek üçin MitoCarta 3.0, Gen Ontology (GO) derňewini we A. Ting we ş.m. ulandyk.mitokondriýa, ýadro we ER üçin 73.4, 78.5 we 73.0% takyklygyna laýyk gelýän anyklanan beloklaryň organelle aýratynlygyny barlamak üçin maglumatlar set8 ulanyldy (3-nji surat).PDPL-iň aýratynlygy, PDPL-iň organelle mahsus beloklary kesgitlemek üçin iň oňat guraldygyny tassyklaýar.Identifiederi gelende aýtsak, kesgitlenen mitohondrial beloklaryň subokondrial derňewi, duzaga düşen proteomyň esasan matrisada we içki membranada paýlanandygyny görkezdi (degişlilikde 226 we 106), kesgitlenen mitohondrial beloklaryň umumy sanynyň 91,7% -ini (362) düzýär.PDPL-iň ýokary derejesi goşmaça tassyklandy (Goşmaça 7a surat).Şonuň ýaly-da, ýadro ýadro derňewi ele alnan proteomyň esasan ýadro, nukleoplazma we ýadro paýlanandygyny görkezdi (Goşmaça 7b surat).Nuclearadro lokalizasiýa signaly peptidi (3xNLS) bilen ýadro proteomiki derňewi H2B konstruksiýasyna meňzeş takyklygy görkezdi (Goşmaça 7c - h).PDPL markeriniň aýratynlygyny kesgitlemek üçin ýadro laminin A has has lokallaşdyrylan POI7 duzagy hökmünde saýlandy.PDPL ep-esli baýlaşdyrylan 36 beloky kesgitledi, şolardan 12 sany belok (A laminany goşmak bilen 30.0%) gowy häsiýetli lamin A, özara täsir edýän beloklar, BioID usulyndan (122 belok) 28, 22.9-dan has ýokary göterim. %) 7. Usulymyz has az beloklary kesgitledi, belki çäkli bellikli ýerler sebäpli, has işjeň ýeke kislorod arkaly mümkin boldy.GO derňewi kesgitlenen beloklaryň esasan nukleoplazmada (26), ýadro membranasynda (10), ýadro membranasynda (9) we ýadro gözeneklerinde (5) ýerleşendigini görkezdi.Köpçülikleýin ýagdaýda bu ýadro lokallaşdyrylan beloklar baýlaşdyrylan beloklaryň 80% -ini emele getirip, PDPL-iň aýratynlygyny görkezýär (Goşmaça 8a - d).
PDPL-iň organellerde ýakynlyk belligini ýerine ýetirmek ukybyny kesgitlänimizden soň, PDPL-iň POI baglanyşdyryjy hyzmatdaşlaryny seljermek üçin ulanyp boljakdygyny barladyk.Hususan-da, ýokary dinamiki tebigaty sebäpli membrananyň lokallaşdyrylan kärdeşlerinden has kyn maksat hasaplanýan sitosoliki beloklaryň PDPL derňewini kesgitlemäge synanyşdyk.BRD4 bromodomain we ekstraterminal (BET) belogy 35, 36 dürli kesellerde esasy orny üçin ünsümizi çekdi.BRD4 tarapyndan emele gelen toplum transkripsiýa koaktiwator we möhüm bejeriş maksadydyr.C-myc we Wnt5a transkripsiýa faktorlarynyň aňladylyşyny kadalaşdyrmak bilen, BRD4 ýiti mieloid leýkemi (AML), köp miýeloma, Burkittiň lenfomasy, içegäniň düwnük keseli we çiş keselleriniň esasy kesgitleýjisi hasaplanýar.Mundan başga-da, käbir wiruslar papillomawirus, AIW we SARS-CoV-236,39 ýaly wirus we öýjükli transkripsiýany kadalaşdyrmak üçin BRD4-ni nyşana alýar.
PDPL ulanyp, BRD4 täsirini kartalaşdyrmak üçin, miniSOG-y BRD4-iň gysga N- ýa-da C terminaly izoformy bilen birleşdirdik.Proteom netijeleri iki konstruksiýanyň arasynda ýokary derejede gabat gelýändigini ýüze çykardy (Goşmaça 9a surat).MiniSOG-H2B bilen kesgitlenen ýadro proteomy, BRD4 bilen täsirleşýän beloklaryň 77,6% -ini öz içine alýar (Goşmaça 9b surat).Soňra markeriň radiusyny sazlamak üçin dürli yşyklandyryş wagtlary (2, 5, 10, 20 min) ulanyldy (4a surat we goşmaça maglumatlar 3).Has gysga fotoperiodlarda, PDPL ilkinji nobatda gönüden-göni baglaýjy hyzmatdaşlary bellär, has uzak döwür gysga fotoaktiwasiýa döwründe kesgitlenen beloklary we bellik toplumlarynda gytaklaýyn nyşanlary öz içine alar diýen netijä gelýäris.Aslynda, ýanaşyk wagt nokatlarynyň arasynda berk meňzeşligi tapdyk (2 we 5 minut üçin 84,6%; 5 we 10 minut üçin 87,7%; 10 we 20 minut üçin 98,7%) (4b surat we goşmaça surat 9c).Synag toparlarynyň hemmesinde diňe BRD4 öz-özüne bellik etmek bilen çäklenmän, setir maglumatlar bazasynda bellik edilen MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A we HMGB1 ýaly birnäçe belli nyşanlary tapdyk.Bu nyşanlaryň ion güýji täsir ediş wagtyna proporsionaldyr (4-nji surat we goşmaça surat 9d).2 minutlyk toparda kesgitlenen beloklaryň GO seljermesi, kesgitlenen beloklaryň ýadroda lokalizasiýa edilendigini we hromatiniň täzelenişine we RNK polimeraza işine gatnaşandygyny görkezdi.Belogyň molekulýar funksiýasy, BRD4 funksiýasyna laýyk gelýän hromatin baglaýjy ýa-da transkripsiýa koaktiwasiýa bilen baýlaşdyryldy (4d-nji surat).Maglumat bazasy bilen üpjün edilen beloklaryň özara täsir derňewi, BRD4 we HDAC baglanyşdyryjy asetilleşdirilen gistonlara laýyk gelýän SIN3A, NCOR2, BCOR we SAP130 (4e surat we goşmaça surat 9e) ýaly BRD4 we HDAC maşgala täsirleşýän toplumlarynyň arasynda gytaklaýyn täsirleriň birinji derejesini ýüze çykardy. ..Mundan başga-da, Sin3A, NSUN2, Fus we SFPQ ýaly LC-MS / MS tarapyndan kesgitlenen wekilçilikli maksatlar, Günbatar partlamasy bilen tassyklandy (4f surat).Recentlyakynda, BRD4-iň gysga izoformynyň suwuk-suwuk faza bölüniş (LLPS) häsiýetli ýadrolary emele getirýändigi habar berildi.RNA birleşdiriji beloklar Fus we SFPQ dürli öýjükli prosesleriň LLPS-sine araçylyk edýär we bu ýerde hasaba alynmadyk BRD4 birleşdiriji beloklar hökmünde kesgitlenildi.BRD4 bilen SFPQ arasyndaky özara täsir, bilelikde immunopripsitasiýa (bilelikde IP) synaglary bilen tassyklandy (4g surat), BRD4-töwekgelçilikli suwuk-suwuk fazany bölmek üçin başga bir mehanizmi teklip edip, has derňew geçirmeli.Bu netijeler bilelikde alnanda, PDPL-iň belli BRD4 täsirleşýän we näbelli birleşdiriji beloklary kesgitlemek üçin iň oňat platforma bolandygyny görkezýär.
miniSOG-töwellaçylykly BRD4 ýakynlyk belgisiniň shema görnüşi, täsir ediş wagty: 2, 5, 10 we 20 min.b Dürli yşyklandyryş wagtlarynda kesgitlenen beloklaryň bir-birine gabat gelmegi.HEK293T-miniSOG-BRD4-de kesgitlenen beloklary baýlaşdyrmak, ýabany görnüşli HEK293T bilen deňeşdirilende statistik taýdan möhümdi.c Bellenen ekspozisiýa wagtynda belli BRD4 baglaýjy beloklary bellik edilmedik wekili kesgitläniňde Ion intensiwligi.n = 3 biologiki taýdan garaşsyz nusga.Maglumatlar ortaça ± standart gyşarma hökmünde görkezilýär.d 2 minutlyk toparda kesgitlenen beloklaryň gen ontologiki derňewi.Ilkinji on sany GO termini sanalandyr.Köpürjikler GO termin kategoriýasyna görä reňklenýär we köpürjik ululygy her terminde tapylan beloklaryň sanyna proporsionaldyr.e BRD4 bilen täsirleşýän beloklaryň setir derňewi.Sary tegelekler göni ýelim we çal tegelekler gytaklaýyn ýelimiň birinji gatlagydyr.Gyzyl çyzyklar synag arkaly kesgitlenen täsirleri, gök çyzyklar bolsa çak edilýän täsirleri aňladýar.f LC-MS / MS-de kesgitlenen BRD4 wekilçilikli maksatlary, günbatar partlamalary bilen tassyklandy.g Bilelikdäki immunopripsitasiýa synaglary SFPQ bilen BRD4 arasyndaky täsirini tassyklaýar.Bu synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen azyndan iki gezek özbaşdak gaýtalandy.Çig maglumatlar çig mal faýllary görnüşinde berilýär.
Bellige alynmadyk POI bilen baglanyşykly nyşanlary kesgitlemekden başga-da, PDPL fermentler üçin substratlary kesgitlemek üçin amatly bolar diýip çaklaýarys, bu hasaba alynmadyk substratlary bellemek üçin uly toplumlarda gytaklaýyn baglaýjy beloklaryň häsiýetlendirilmegini talap eder.Parkin (PARK2 bilen kodlanan) E3 ligasydyr we parkindäki mutasiýa, awtosomal resessiw ýetginjek Parkinson keseline (AR-JP) 42 sebäp bolýar.Mundan başga-da, parkin mitofagy (mitokondrial awtofagy) we reaktiw kislorod görnüşlerini ýok etmek üçin zerur diýlip häsiýetlendirildi.Şeýle-de bolsa, birnäçe parkin substraty ýüze çykarylsa-da, parkiniň bu keseldäki roly näbelliligine galýar.Özüniň häsiýetlendirilmedik substratlaryny düşündirmek üçin PDPL parkiniň N- ýa-da C terminalyna miniSOG goşmak bilen synag edildi.Öýjükler, PINK1-Parkin ýoly arkaly parkini işjeňleşdirmek üçin karbonil sianid proton daşaýjy m-hlorofenilhidrazon (CCCP) bilen bejerildi.BRD4 PDPL netijelerimiz bilen deňeşdirilende, parkin N-terminus birleşmesi, C terminalynyň has köp bölegini (210-dan 177) öz içine alsa-da, has köp maksatly beloklary ýüze çykardy (5a surat, b we goşmaça maglumatlar 4).Netijede, N-terminal bellikleriniň Parkin44-i işjeňleşdirip biljekdigi baradaky habarlar gabat gelýär.Geň zat, Parkin43 üçin neşir edilen AP-MS netijeleri bilen maglumatlarymyzda bary-ýogy 18 sany gabat gelýän belok bar, bu öýjük çyzyklary bilen proteomika işleriniň arasyndaky tapawutlar sebäpli bolup biler.Iki usul bilen kesgitlenen dört belli belokdan başga-da (ARDM1, HSPA8, PSMD14 we PSMC3) 43.LC-MS / MS-iň netijelerini has-da tassyklamak üçin, HEK293T esasy öýjük barlagynyň netijelerini we durnukly N terminaly parkin çyzygyny deňeşdirmek üçin PDPL bejergisi we soňraky Günbatar partlamalary ulanyldy.Öň näbelli nyşanlar CDK2, DUT, CTBP1 we PSMC4 belli bir baglaýjy, DNAJB1 bilen synag edildi (5-nji surat).
HEK293T öýjüklerindäki parkin bilen täsirleşýän beloklaryň wulkan meýilnamasy, durnukly görkezilen miniSOG bilen parkiniň N- ýa-da C terminalyna birleşdirildi (n = 3 garaşsyz biologiki synag).Iki guýrukly Talyp synagy wulkan meýdançalarynda ulanyldy.Negativearamaz gözegçilik hökmünde HEK293T ulanyldy. Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi tapawudy). Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> 2 esse ion intensiwligi tapawudy). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интеншности ионов). Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> ion intensiwliginde 2 esse tapawut).<着 变化 变化 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异。。<着 变化 <<<<0.05 和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Üýtgedilen beloklar gyzyl reňkde görkezilýär (p <0.05 we> ion güýjüniň 2 esse tapawudy).HEK293T-miniSOG üçin möhüm, ýöne HEK293T üçin möhüm däl beloklar ýaşyl reňkde görkezilýär.b N terminaly we C terminaly konstruksiýalaryň arasynda birmeňzeş beloklary görkezýän Wenn diagrammasy.N terminaly bellikler parkini düýbünden işjeňleşdirip biler we has tanalýan beloklary döredip biler.c PDPL bilen AP-MS arasynda biri-birine gabat gelýän beloklary görkezýän Wenn diagrammasy.Belli interaktorlar sanawda, biri-birine gabat gelýän 18 belokdan 4-si we PDPL-de ýörite kesgitlenen 159 belokdan 11-si bar.d LC-MS / MS tarapyndan kesgitlenen wekilçilikli maksatlar, günbatar partlamalary bilen tassyklandy.e Ssu72 we SNW1 hasaba alynmadyk parkin substratlary hökmünde kesgitlenildi.Bu FLAG bellikli belok plazmidleri HEK293T we HEK293T-Parkin-miniSOG-a geçirildi, soňra dürli wagt nokatlarynda CCCP bejergisi.Zaýalanmagy Parkiniň aşa aşa gysyş setirinde has aýdyň ýüze çykdy.f MG132 proteazome inhibitoryny ulanyp, Ssu72 we SNW1 zaýalanmak prosesiniň proteazoma-hemme ýerde ulanylmagy bilen töwella edilýändigi tassyklandy.Bu synaglar şuňa meňzeş netijeler bilen azyndan iki gezek özbaşdak gaýtalandy.Çig maglumatlar çig mal faýllary görnüşinde berilýär.
Peri gelende aýtsak, PDPL tarapyndan kesgitlenen beloklarda parkin baglaýjy beloklar we olaryň aşaky gatlaklary bolmaly.Bellige alynmadyk parkin substratlaryny ýüze çykarmak üçin kesgitlenen ýedi sany belogy saýladyk (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 we SNW1) we bu genleri adaty HEK293T derejesine ýetirmek üçin plazmidi geçirdik we miniSOG-Parkiniň HEK293T, soň bolsa CCCP bejergisi.Durnukly miniSOG-Parkin çyzygynda Ssu72 we SNW1 beloklarynyň derejesi ep-esli azaldy (5e-nji surat).CCCP bilen 12 sagatlap bejermek, iki substratyň iň möhüm zaýalanmagyna getirdi.Ssu72 we SNW1-iň zaýalanmagynyň proteazoma-hemme ýerde ulanylmagy bilen kadalaşýandygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin proteazoma inhibitory MG132 proteazoma işjeňligini saklamak üçin goşuldy we aslynda olaryň zaýalanmagynyň päsgel berendigini gördük (5-nji surat).Goşmaça substrat däl maksatlar, LC-MS / MS bilen yzygiderli netijeleri görkezýän Günbatar partlamasyny (Goşmaça 10-njy surat) ulanyp, Parkin interaktorlary hökmünde tassyklandy.Sözümiň ahyrynda, PDPL iş akymynyň maksatly belok transfeksiýasyny barlamak bilen birleşdirilmegi, hasaba alynmadyk E3 ligase substratlaryny kesgitlemäge mümkinçilik berýär.
POI-ler bilen giňişlikde we wagt bilen kesgitlemäge mümkinçilik berýän umumy ýakynlygy bellemek platformasyny taýýarladyk.Platforma takmynan 12 kDa bolan, ýetişen APEX2 fermentiniň (27 kDa) we TurboID (35 kDa) ululygynyň üçden bir böleginden az bolan miniSOG fotosensilizator belogyna esaslanýar.Has kiçi göwrüm, kiçi belok interaktomlaryny öwrenmek üçin amaly programmalaryň gerimini ep-esli giňeltmeli.Genetiki kodlanan beloklar ýa-da ownuk molekulalar bolsun, goşmaça fotosensilizatorlary has giňişleýin gözlemek, ýeke kislorodyň kwant öndürijiligini ýokarlandyrmak we bu çemeleşmäniň duýgurlygyny giňeltmek üçin zerurdyr.MiniSOG-yň häzirki wersiýasy üçin ýakynlyk belliklerini işjeňleşdirmek üçin gök yşyklandyryş arkaly ýokary wagtlaýyn çözgüt gazanyp bolýar.Mundan başga-da, has köp täsir etmek wagty has kislorodyň has uly “buludyny” çykardy, netijede has distal histidiniň galyndylarynyň üýtgemegi, bellik radiusynyň ýokarlanmagy we PDPL giňişlik çözgüdini sazlamak ukyby ýüze çykdy.Şeýle hem, signalyň fona bolan gatnaşygy ýokarlandyrmak üçin ýedi sany himiki barlagy synagdan geçirdik we bu çemeleşmäniň aňyrsynda molekulýar mehanizmi öwrendik.TOP-ABPP iş tertibi bitarap açyk gözleg bilen utgaşyp, üýtgeşmeleriň diňe histidinlerde bolup geçendigini we aýlaw sebitindäki histidinleriň ortaça ileri tutulmagyndan başga, histidiniň üýtgemegi üçin yzygiderli mikro-gurşawyň bolmandygyny tassyklady.
PDPL, öýjükli proteomlary proteom aýratynlygy we iň bolmanda beýleki ýakynlyk bellikleri we organelle mahsus himiki gözleg usullary bilen deňeşdirip boljak örtük bilen häsiýetlendirmek üçin ulanyldy.Xakynlyk bellikleri, ýerüsti, lizosomal we sekretom bilen baglanyşykly proteomlary häsiýetlendirmek üçin üstünlikli ulanyldy46,47.PDPL-iň bu öýjükli organelller bilen gabat geljekdigine ynanýarys.Mundan başga-da, dinamiki häsiýetleri we has wagtlaýyn täsirleşmeleri sebäpli membrana bagly beloklardan has çylşyrymly sitosoliki belok baglanyşygynyň nyşanlaryny kesgitlemek bilen PDPL-e garşy çykdyk.PDPL iki belok, transkripsiýa koaktiwator BRD4 we kesel bilen baglanyşykly E3 Parkin üçin ulanyldy.Bu iki belok diňe bir esasy biologiki funksiýalary üçin däl, eýsem kliniki ähmiýeti we bejeriş mümkinçilikleri üçin hem saýlandy.Bu iki POI üçin belli hökmany hyzmatdaşlar we hasaba alynmadyk nyşanlar kesgitlenildi.Feri gelende aýtsak, fazany bölmek bilen baglanyşykly belok SFPQ bilelikde BR tarapyndan tassyklandy, bu BRD4 (gysga izoform) LLPS-i kadalaşdyrýan täze mehanizmi görkezip biler.Şol bir wagtyň özünde, Parkin substratlaryny kesgitlemegiň gytaklaýyn ýelimleri kesgitlemegiň zerur ssenariidigine ynanýarys.Iki sany näbelli parkin substratyny kesgitledik we hemme ýerde-proteazoma ýolunda olaryň zaýalanandygyny tassykladyk.Recentlyakynda gidrolaz substratlaryny fermentler bilen duzak arkaly kesgitlemek üçin mehanizm esasly duzak strategiýasy işlenip düzüldi.Bu gaty güýçli usul bolsa-da, uly toplumlaryň emele gelmegine gatnaşýan substratlary derňemek üçin amatly däl we ferment bilen substratyň arasynda kowalent baglanyşyklaryň emele gelmegini talap edýär.PDPL-iň deubikuitinaza we metalloproteaz maşgalalary ýaly beýleki belok toplumlaryny we ferment maşgalalaryny öwrenmek üçin giňeldilmegine garaşýarys.
SOPP3 diýlip atlandyrylýan miniSOG-yň täze görnüşi, kislorod önümçiliginiň gowulaşmagy bilen işlenip düzüldi.MiniSOG-ny SOPP3 bilen deňeşdirdik we signal-ses sesiniň gatnaşygy üýtgemese-de, gowulaşan bellik öndürijiligini tapdyk (Goşmaça 11-nji surat).SOPP3-iň optimizasiýasy (meselem, gönükdirilen ewolýusiýa arkaly) has gysga wagt talap edýän we has dinamiki öýjükli prosesleriň ele alynmagyna mümkinçilik berýän has täsirli fotosensilizator beloklaryna sebäp bolar diýip çakladyk.Peri gelende aýtsak, PDPL-iň häzirki wersiýasy öýjükli gurşaw bilen çäklenýär, sebäbi gök ýagtylygyň yşyklandyrylmagyny talap edýär we çuň dokumalara aralaşyp bilmeýär.Bu aýratynlyk, haýwanlaryň modellerini öwrenmekde ulanylmagynyň öňüni alýar.Şeýle-de bolsa, optogenetikanyň PDPL bilen birleşmegi haýwanlary öwrenmek üçin esasanam beýnide mümkinçilik döredip biler.Mundan başga-da, beýleki in engineenerli infragyzyl fotosensilizatorlar hem bu çäklendirmäni aýyrýarlar.Häzirki wagtda bu ugurda gözlegler alnyp barylýar.
HEK293T öýjük çyzygy ATCC-den (CRL-3216) alyndy.Öýjük çyzygy mikoplazma ýokaşmasy üçin negatiw synag edildi we DMEM-de (Termo, # C11995500BT) 10% düwünçegiň irin (FBS, Vistech, # SE100-B) we 1% penisillin / streptomisin (Giklon, # SV30010) bilen ösdürilip ýetişdirildi.ulaldy.
“Bidepharm” -dan 3-aminofenilen (3-nji nusga) we (4-etinilfenil) metanamin (4-nji nusga) satyn alyndy.Propilamin (zond 2) Energiýa-himiki serişdelerden satyn alyndy.N- (2-Aminofenil) pent-4-ynamid (zond 1) neşir edilen usullara görä sintez edildi.
Goşmaça 1-nji tablisada bu işde ulanylýan genetiki gurluşlar sanalandyr.MiniSOG we KillerRed yzygiderliligi P. Zou (Pekin uniwersiteti) sowgat plazmidinden klonlaşdyryldy.Mitokondrial matrisa nyşana yzygiderliligi COX4-iň 23 N terminaly aminokislotalaryndan alyndy we Gibson ýygnagy (Beyotime, # D7010S) ulanyp görkezilen wektorlara klonlaşdyryldy.Endoplazmatiki retikulumyň membranasyny we ýadrosyny nyşana almak üçin, HEK293T öýjükleriniň cDNA kitaphanasyndan PCR tarapyndan güýçlendirilen SEC61B adam DNK (NM_006808.3) we H2B DNK (D. Lin, Şençzhenen laboratoriýasy tarapyndan bagyşlandy) we ýokarda aýdylyşy ýaly klonlaşdyryldy.Başga görkezilmedik bolsa, durnukly öýjük çyzyklaryny geçirmek we gurmak üçin ulanylýan beýleki belok genleri HEK293T öýjükli cDNA kitaphanasyndan PCR güýçlendirildi.G3S (GGGS) we G4S (GGGGS) çeňňek belogy bilen miniSOG arasynda baglanyşyk hökmünde ulanyldy.Bu birleşme konstruksiýalaryna V5 epitop belligi (GKPIPNPLLGLDST) goşuldy.Süýdemdirijilerde aňlatmak we durnukly öýjük çyzygyny döretmek üçin miniSOG birleşme konstruksiýasy pLX304 merkezi wektoryna bölündi.Bakteriýalary aňlatmak üçin miniSOG, C terminalynda 6xHis belgili pET21a wektoryna klonlaşdyryldy.
HEK293T öýjükleri alty guýy tarelkadaky guýuda 2,0 x 105 öýjükde ekildi we 24 sagatdan soň Lipo8000 (Beyotime) ulanyp rekombinant mekgejöwen plazmidi (2,4 μg pLX304) we wirus gaplaýyş plazmidleri (1,5 μg psPAX2 we 1,2 μg pMD2.G) bilen transfeksiýa edildi. , # C0533), takmynan 80% birleşmek.Bir gijelik transfeksiýadan soň, gurşaw üýtgedildi we ýene 24 sagat inkubasiýa edildi.Wirusy ýygnamak 24, 48 we 72 sagatdan soň geçirildi.Maksatly öýjük çyzyklaryna ýokaşmazdan ozal wirus serişdesi 0,8 mkm süzgüç (Merk, # millex-GP) arkaly süzüldi we 8 μg / ml konsentrasiýasyna polibren (Solarbio, # H8761) goşuldy.24 sagatdan soň öýjükleri gurşawy üýtgedip dikeltmäge rugsat berildi.Öýjükler has pes seçim hökmünde ilkinji üç bölek üçin 5 μg / ml blastidin (Solarbio, # 3513-03-9) ulanylyp saýlandy.Soňra indiki üç bölüm üçin has berk re asim hökmünde 20 μg / ml ulanyldy.
Öýjükler 12 guýy kamerada (Ibidi, # 81201) takmynan 20 000 öýjük dykyzlygynda ekildi.HEK293T öýjükleriniň ýelmeşmegini gowulandyrmak üçin, 37 ° C-de fosfat buferli duzda (PBS, Sangon, # B640435) 50 µg / ml fibronektin (Corning, # 356008) goşuň.Otaglar 1 sagat öňünden taýýarlandy, soň bolsa PBS bilen aýryldy.24 sagatdan soň, öýjükler PBS bilen bir gezek ýuwuldy, täze Hanksyň deňagramly duz ergininde (HBSS, Gibco, # 14025092) 37 ° C-de 1 sagatda inkubasiýa edildi, soňra gök LED (460 nm) bilen inkubasiýa edildi. ).) otag temperaturasynda 10 minut şöhlelendi.Şondan soň öýjükler PBS bilen iki gezek ýuwuldy we otag temperaturasynda 15 minutlap PBS-de (Sangon, # E672002) 4% formaldegid bilen berkitildi.Artykmaç formaldegid durnukly öýjüklerden PBS bilen üç gezek ýuwuldy.Öýjükler soňra PBS-de 0,5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) bilen permabilizasiýa edildi we PBS bilen 3 gezek ýuwuldy.Soňra kamerany aýyryň we her nusga 50 µM Cy3-azid (Aladdin, # C196720), 2 m CuSO4 (Sangon, # A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, # BDJ-4) bolan reaksiýa garyndysynyň 25 µl goşuň. we 0,5 mg / ml natriý askorbat (Aladdin, S105024) we otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa edildi.Birneme reaksiýadan soň öýjükler 0.05% Tween-20 (Sangon, # A600560) (PBST) bolan PBS bilen alty gezek ýuwuldy we otag temperaturasynda PBST-de 5% BSA (Abcone, # B24726) bilen ýapyldy.
Kolokalizasiýa immunizasiýa etmek üçin öýjükler görkezilen şertlere laýyklykda esasy antikorlary bilen inkubasiýa edildi: syçanjyga garşy V5 belligi mAb (1: 500, CST, # 80076), towşan anti-Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, # A0564), towşan poliklonal anti-kalnexin antikor (1: 500, Abcam, # ab22595) ýa-da bir gije 4 ° C derejesinde towşan anti-lamin A / C monoklonal antikor (1: 500; CST, # 2032).PBST bilen 3 gezek ýuwlandan soň, öýjüklere ikinji derejeli antikorlar goşuldy: towşana garşy Alexa Fluor 488 (Termo, # A11034) 1: 1000, geçi garşy Alexa Fluor 594 (CST, # 8889) 1: 1000 suwuklandyryldy.seýreklemek Otagyň temperaturasynda 30 minut eritmeli.Öýjükler soňra PBST bilen 3 gezek ýuwuldy we otag temperaturasynda 10 minutlap PBS-de DAPI (Thermo, # D1306) bilen garşylandy.PBS bilen 3 ýuwlandan soň, öýjükler surata düşürmek üçin PBS-de 50% gliserolda (Sangon, # A600232) möhürlendi.Immunofloresent şekiller ZEISS LSM 900 Airyscan2 konokok mikroskopy we ZNE 3.5 programma üpjünçiligi arkaly alyndy.
Singleeke-täk kislorod floresan şekillendiriş üçin öýjükler Hanks HEPES buferine (DOJINDO, # MT05) 100 nM Si-DMA goşmazdan ozal Hanks HEPES buferi bilen iki gezek ýuwuldy.Lightagtylyga sezewar bolandan soň, öýjükler 37 ° C derejesinde 45 minutlap CO2 inkubatorda saklandy.Öýjükler Hanksyň HEPES buferi bilen iki gezek ýuwuldy we Hanksyň HEPES buferinde Hoechst bilen 10 minut otag temperaturasynda saklandy we ZEISS LSM 900 konokok mikroskopy arkaly şekillendirildi., # M36008) HBSS buferinde kalsiý we magniý bar.Lightagtylyga ýa-da doksorubisine (MCE, # HY-15142A) täsir edenden soň, öýjükler 37 ° C derejesinde CO2 inkubatorda 10 minutlap inkubasiýa edildi, HBSS buferi bilen iki gezek ýuwuldy we otag temperaturasynda HechS buferinde Hoechst bilen inkubasiýa edildi.minut.Dokorubisin polo positiveitel barlag gözegçiligi hökmünde ulanyldy, bu ýerde öýjükler 30 minutda 1% BSA bolan HBSS-de 20 μM doksorubisin bilen bejerildi.Immunofloresent şekiller Zeiss LSM 900 konokok mikroskopy arkaly alyndy.
Mito-miniSOG-y durnukly aňladýan HEK293T öýjükleri 15 sm gaplarda takmynan 30% dykyzlykda ekildi.48 sagatdan soň, ~ 80% baglanyşyk gazanylandan soň, öýjükler PBS bilen bir gezek ýuwuldy, täze HBSS buferinde 1 mM Probe 3 bilen 37 ° C-de 1 sagatlap inkubasiýa edildi, soň bolsa otagda 10 minut gök LED bilen yşyklandyryldy. temperatura..Ondan soň öýjükler PBS bilen iki gezek ýuwuldy, döwüldi we EDTA-da proteaz ingibitorlaryny öz içine alýan buzly sowuk PBS buferinde ýerleşdirildi (MCE, # HY-K0011).Öýjükler ujuny 1 minut sonikasiýa etmek bilen lizirlendi (1 sekuntda we 35% amplituda 1 sekuntda).Alnan garyndy, galyndylary aýyrmak üçin 4 ° C-de 10 minut üçin 15,871 xg sentrifugasiýa edildi we adatdan daşary konsentrasiýa BCA belok barlag toplumy (Beýotime, # P0009) ulanylyp 4 mg / ml-e düzüldi.Aboveokardaky lizatyň 1 ml-i 0,1 m fotodipleşip bolýan biotin azidi (Confluore, # BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, # A600974), 0,1 m TBTA ligand (Aladdin, # T162437) we 1 m CuSO4 inkubator bilen birleşdiriň. otag temperaturasynda 1 sagat aýlanmak.Birneme reaksiýadan soň, garyndyny 10 ml aýna flakonda öňünden garylan ergine (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) goşuň.Nusgalar garyndy we otag temperaturasynda 10 minutlap 4500 gr merkezden gaçyryldy.Aşaky we ýokarky erginler taşlandy, çökündiler 1 ml metanol bilen iki gezek ýuwuldy we 4 ° C-de 5 minut üçin 15871 × g sentrifugasiýa edildi.Çökgünligi eritmek üçin 25 m ammiak bikarbonata (ABC, Aladdin, A110539) 1 ml 8 karbamid (Aladdin, U111902) goşuň.Nusgalar 55 ° C-de 40 minutda 10 mM ditiothreitol (Sangon, # A100281) bilen 40 minutda gaýtadan dikeldildi, soňra garaňkyda otag temperaturasynda 15 m täze ýodoasetamid (Sangon, # A600539) goşuldy.30 minudyň içinde alkilýasiýa..Reaksiýany duruzmak üçin goşmaça 5 m ditiotreitol goşuldy.Her nusga üçin takmynan 100 µl NeutrAvidin agarose monjuklaryny (Termo, # 29202) 1 ml PBS bilen 3 gezek ýuwup taýýarlaň.Aboveokardaky proteome ergini 5 ml PBS bilen garyndy we öňünden ýuwulan NeutrAvidin agarose monjuklary bilen otag temperaturasynda 4 sagat inkubasiýa edildi.Soňra monjuklar 0,2% SDS (Sangon, # A600485) bolan 5 ml PBS bilen 3 gezek, 1M karbamidini öz içine alýan 5 ml PBS bilen 3 gezek we 5 ml ddH2O bilen 3 gezek ýuwuldy.Monjuklar soňra sentrifugasiýa bilen ýygnaldy we 1 M karbamid, 1 mM CaCl 2 (Maklin, # C805228) we 20 ng / μl tripsin (Promega, # V5280) bolan 25 mM ABC-de 200 μl gaýtadan işledildi.Bir gije 37 ° C-de aýlanmak bilen synap görüň.Reaksiýa pH 2-3-e ýetýänçä formik kislotany (Termo, # A117-50) goşmak bilen saklandy.Monjuklar 0,2% SDS bolan 1 ml PBS bilen 3 gezek, 1 M karbamidini öz içine alýan 1 ml PBS bilen 3 gezek, soňra bolsa 1 ml distillendirilen suw bilen 3 gezek ýuwuldy.Üýtgedilen peptidler, 70% MeOH-dan 200 μl ulanyp, 90 minut ýeňil liz (365 nm) bilen goýberildi.Merkezden gaçyryşdan soň adatdan daşary tebigat ýygnaldy.Mundan soň monjuklar 100 μl 70% MeOH bilen bir gezek ýuwuldy we adatdan daşary tebigatlar birleşdirildi.Nusgalar “Speedvac” wakuum konsentratorynda guradyldy we seljerişe çenli -20 ° C derejesinde saklandy.
Kislorod üýtgedilen peptidleri kesgitlemek we bahalandyrmak üçin nusgalar 0,1% formik kislotada gaýtadan eritildi we satyjy programma üpjünçiliginden Tune we Xcalibur-dan nano ESI çeşmesi bilen enjamlaşdyrylan Orbitrap Fusion Lumos Tribrid köpçülik spektrometri arkaly 1 μg peptid analiz edildi.Nusgalar 3 µm C18 material (ReproSil-pur, # r13.b9.) Bilen 75 µm × 15 sm içerki gaplanan kapilýar sütüninde bölünip, EASY-nLC 1200 UHPLC ulgamyna (Termo) birikdirildi.Peptidler çyzykly 95 minutlyk gradient hromatografiýasy bilen 8% çözüji B-den 50% çözüji B (suwda A = 0,1% kislotasy, 80% asetonitrilde B = 0,1% kislotasy) bilen bölünip, çyzykly 98% B min çenli ýokarlandy. akym tizliginde 6 minutda 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos, maglumatlara baglylykda doly MS skaner bilen MS2 skaneriň arasynda gezekli-gezegine maglumat ýygnaýar.Tüýdük naprýa .eniýesi 2,1 kW, ion transport kapilýarynyň temperaturasy 320 ° C.MS spektrleri (350-2000 m / z) 120,000, AGC 4 × 105 durulykda we iň köp giriş wagty 150 ms.Her doly skanerde iň köp ýaýran 10 zarýadly prekursor, 30% kadaly çaknyşma energiýasy, 1,6 m / z dörtburç izolýasiýa penjiresi we 30,000 ölçegli HCD ulanyp böleklere bölünipdi.5 × 104 we iň ýokary giriş wagty 150 ms ulanyp, tandem köpçülik spektrometri üçin AGC nyşany.Dinamiki kadadan çykma 30 sekuntda düzüldi. Bellenmedik ionlar ýa-da 1+ we> 7+ zarýadlylar MS / MS üçin ret edildi. Bellenmedik ionlar ýa-da 1+ we> 7+ zarýadlylar MS / MS üçin ret edildi. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS üçin 1+ we> 7+ zarýad berilmedik ionlar ýa-da ionlar ret edildi.+ 指定 的 离子 + + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。+ 指定 的 离子 + + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS üçin 1+ we> 7+ tölegli kesgitlenmedik ionlar ýa-da ionlar ret edildi.
Çig maglumatlar MSFragger esasly FragPipe hasaplaýyş platformasy arkaly işlenýär.Köpçülikleýin taraplar we degişli aminokislotalar -150-den 500 Da çenli köpçülikleýin çydamlylygy bolan açyk gözleg algoritmini ulanmak arkaly kesgitlenildi.Üýtgedilen peptidler soňra PD-da +229.0964 we +247.1069 Da köp girdeji gazanan histidin üýtgemelerini ulanyp kesgitlenildi (Proteome Discoverer 2.5, Termo).
Birleşdirilen miniSOG genini durnukly aňladýan öýjükler 6 sm gapda gaplandy.Öýjükler ~ 80% -e ýetensoň, HBSS (Gibco, # 14025092) bilen bir gezek ýuwuldy, soňra HBSS-de himiki zondlar bilen 37 ° C-de 1 sagatlap inkubasiýa edildi we gök çyra bilen yşyklandyryldy.Otag temperaturasynda 20 minutlyk 10W LED.PDPL, 0,5 m witamin C (MCE, # HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, # HY-101445), D2O (Sigma, # 7789-20-0) haýsy reaktiw kislorod görnüşiniň bardygyny anyklamak üçin, Öýjüklere goşundy hökmünde 100 mM mannitol (Energy Chemical, 69 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 goşuldy.Sowuk PBS bilen ýuwlandan soň, öýjükler gyryldy, 1,5 ml sentrifuga turbalarynda ýygnaldy we EDTA-dan (1 s we 1 s, amplituda 35%) 200 μl PBS-de 1 minut üçin bir ujy bilen sonikasiýa edildi.Alnan garyndy, 4 ° C-de 10 minut üçin 15,871 × g sentrifugasiýa edildi we adatdan daşary konsentrasiýa BCA belok analiz toplumyny ulanyp 1 mg / ml-e düzedildi.Aboveokardaky lizatyň takmynan 50 µl 0,1 m rodamin azid (Aladdin, .13131368), 1 mM TCEP, 0,1 m TBTA bagy we 1 mM CuSO4 otag temperaturasynda aşakdan ýokara aýlanmak bilen inkubasiýa edildi.Basmak reaksiýasyndan soň, nusgalara 250 μl öňünden sowadylan aseton goşmak, 20 minut üçin -20 ° C inkubasiýa etmek we 4 minutda 10 minut üçin 6010 × g sentrifugasiýa etmek arkaly aseton bilen ýagyş amala aşyryldy.Pelleti ýygnaň we 1x Laemmli buferiniň 50 µl-da 95 ° C-de 10 minut gaýnadyň.Soňra nusgalar SDS-PAGE uzyn jellerde derňeldi we Image Lab Touch programma üpjünçiligi bilen Bio-rad ChemiDoc MP Touch şekillendiriş ulgamy arkaly wizuallaşdyryldy.
Rekombinant miniSOG-6xH belogyny aňlatmak we arassalamak öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi.Gysgaça, E. coli BL21 (DE3) öýjükleri (TransGen, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis bilen üýtgedildi we 0,5 mM IPTG (Sangon, # A600168) bilen belok aňlatmasy ýüze çykdy.Öýjük lizisinden soň, beloklar Ni-NTA agarose monjuklary (MCE, 66 70666) bilen arassalanyp, PBS-e garşy dializ edildi we –80 ° C derejesinde saklandy.
Antikorlara esaslanýan in vitro etiketkasyna ýakynlygy öwrenmek üçin, 100 μM arassalanan miniSOG, 1 mM zond 3 we 1 μg bellige garşy syçanjygyň monoklonal antikoryny (TransGen, # HT501-01) umumy reaksiýa göwrümine 50 μl garyşdyryň..Reaksiýa garyndysy otag temperaturasynda 0, 2, 5, 10 we 20 minut gök LED çyra bilen şöhlelendi.Garyndy 0,1 mM biotin-PEG3-azid (Aladdin, # B122225), 1 m TCEP, 0,1 m TBTA bagy we 1 m CuSO4 bilen ýokary hereket hereketlendirijisinde otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa edildi.Birneme reaksiýadan soň garyndynyň içine 4x Laemmli buferini goşuň we 95 ° C-de 10 minut gaýnadyň.Nusgalar SDS-PAGE jellerinde seljerildi we streptawidin-HRP (1: 1000, Solarbio, # SE068) bilen günbatar partlamalary arkaly seljerildi.
C terminaly amidasiýa (LHDALDAK-CONH2) bilen gistidini öz içine alýan sintetiki peptid, vitro belliklerinde golaýdaky peptid esasly analiz etmek üçin ulanyldy.Bu gözlegde, 100 μM arassalanan miniSOG, 10 mM zond 3 we 2 μg / ml sintetiki peptid umumy reaksiýa göwrüminde 50 μl mukdarda garyndy.Reaksiýa garyndysy otag temperaturasynda 1 sagat gök LED çyra bilen şöhlelendi.Bir mikrolitr LC-MS ulgamy (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility MassLynx spektr derňew programma üpjünçiligi bilen uçuş wagty-köpçülik spektrometri) arkaly derňeldi.
MiniSOG birleşme genini durnukly aňladýan HEK293T öýjükleri, dürli organelle lokalizasiýasy (Mito, ER, Nucleus) we Parkin-miniSOG we BRD4-miniSOG setirleri üçin 10 sm gaplara 10 sm gap-gaçlara ekildi.~ 90% aralykda ýetensoň, öýjükler HBSS bilen bir gezek ýuwuldy, soňra HBSS-de 3 zond bilen 37 ° C-de 1 sagatlap inkubasiýa edildi we otag temperaturasynda 10 Wt gök LED bilen yşyklandyryldy.Parkiniň kontakt däl bellikleri üçin HBSS-de 3-nji zond bilen 10 µM proton karbonil sianid daşaýjy m-hlorofenilhidrazon CCCP (Solarbio, # C6700) 37 ° C-de 1 sagat goşuldy.Öýjük lizisi, basmak himiýasy, azaltmak we alkilýasiýa ädimleri ýokarda görkezilişi ýaly boldy, 2 mg lizat goşulandan we fotodegrasiýa edilip bilinýän biotin azidiň ýerine basmak reaksiýasynda biotin PEG3 azidi ulanyldy.Baýlaşdyrylandan soň monjuklar 0,2% SDS bolan 5 ml PBS bilen 3 gezek, 1 M karbamidini öz içine alýan 5 ml PBS bilen 3 gezek we 5 ml PBS bilen 3 gezek ýuwuldy.Ondan soň, bir gije 37 ° C-de belogy ýapmak üçin 1 M karbamid bolan 300 µl 25 mM ABC-e 2 µg tripsin goşuldy.Reaksiýa, pH 2-3-e ýetýänçä formik kislotany goşmak bilen saklandy.Monjuklarda tripsinizasiýa geçirilenden soň, peptid ergini SOLAµ HRP sütüni (Termo, # 60209-001) bilen duzlandy we Speedvac vakuum konsentratorynda guradyldy.Peptidler 0,1% formik kislotada gaýtadan eritildi we ýokarda görkezilen nano-ESI çeşmesi bilen enjamlaşdyrylan Orbitrap Fusion Lumos Tribrid köpçülik spektrometri arkaly 500 ng peptid analiz edildi.Peptidler täjirçilik RP-HPLC deslapky sütünlerinde (75 μm x 2 sm) (Termo, 49 164946) we analitiki RP-HPLC sütünlerinde (75 μm x 25 sm) (Termo, 49 164941) bölünip aýryldy, ikisi hem 2 μm bilen dolduryldy.gradient 60 minutda 8% -den 35% ACN, soň bolsa 300 Nl / min akym tizliginde 6 minutda 98% B çenli ýokarlandy.MS spektrleri (350-1500 m / z) 60,000, AGC 4 × 105 durulykda we iň köp giriş wagty 50 ms.Saýlanan ionlar, HCD tarapyndan 30 s kadalaşdyrylan çaknyşyk energiýasy, 1,6 m / z dörtburç izolýasiýa penjiresi we 15000 durulyk bilen 3 s aýlawda yzygiderli bölünipdi. 5 × 104 tandem köpçülik spektrometri AGC nyşany we iň ýokary sanjym wagty 22 ms ulanyldy.Dinamiki çykarmak 45 sekuntda düzüldi. Bellenmedik ionlar ýa-da 1+ we> 7+ zarýadlylar MS / MS üçin ret edildi. Bellenmedik ionlar ýa-da 1+ we> 7+ zarýadlylar MS / MS üçin ret edildi. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS üçin 1+ we> 7+ zarýad berilmedik ionlar ýa-da ionlar ret edildi.+ 指定 的 离子 + + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。+ 指定 的 离子 + + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. MS / MS üçin 1+ we> 7+ tölegli kesgitlenmedik ionlar ýa-da ionlar ret edildi.
NeutrAvidin monjuklaryny baýlaşdyrmak üçin taýýarlyk ädimleri ýokarda beýan edilen LC-MS / MS derňewindäki ýalydy.Loükleme gözegçiligi üçin giriş hökmünde takmynan 50 μg lizat we basmak reaksiýalary üçin 2 mg lizat ulanyldy.Neýtrawidin bilen baýlaşdyrylandan we ýuwulandan soň, baglanan beloklar agarose rezin monjuklaryna 50 μl Laemmli buferini goşup, 95 ° C-de 5 minut gaýnadyp, köpeldi.Dolandyryş ýük girişi we monjuk bilen baýlaşdyrylan nusgalar SDS-PAGE tarapyndan derňelip, Günbatar blot usullary bilen PVDF membranalaryna (Millipore, # ISEQ00010) geçirildi.Membranalar 5% süýtli süýt (Sangon, # A600669) bilen TBS-de 0,1% 20 (TBST) saklanýar we yzygiderli esasy we ikinji antikorlary bilen inkubasiýa edilýär.Ilkinji antikorlar TBST-de 5% süýtde 1: 1000 suwuklandyryldy we bir gije 4 ° C-de inkubasiýa edildi.Ikinji derejeli antikorlar 1: 5000 nisbatynda ulanyldy we otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa edildi.Membranalar Chemidoc MP şekillendiriş ulgamyny ulanyp, himiluminesensiýa arkaly şekillendirildi.Suratdaky bölekleriň we jelleriň kesilmedik skanerleri çig maglumatlar hökmünde görkezilýär.
Bu gözlegde ulanylýan esasy antikorlara towşan anti-SFPQ monoklonal antikor (CST, 71 71992), towşan anti-FUS monoklonal antikor (CST, 67 67840), towşan anti-NSUN2 poliklonal antikor (Proteintech, 20854-1-) degişlidir. AP), towşan anti-mSin3A poliklonal antikor (Abcam, # ab3479), syçanjyga garşy monoklonal antikor (TransGen, # HT201-02), syçanyň anti-aktin monoklonal antikor (TransGen, # HC201-01), towşan garşy -CDK2 monoklonal antikor (ABclonal, # A0094), CTBP1 (ABclonal, # A11600) towşan monoklonal antikor, DUT (ABclonal, # A2901) towşan poliklonal antikor, PSMC4 (ABclonal, # A2505) towşan poliklonal antikor. DNAJB1 poliklonal antikor (ABclonal, # A5504).Bu antikorlar TBST-de 5% süýtde 1: 1000 eritmede ulanyldy.Bu gözlegde ulanylýan ikinji derejeli antikorlara, 1: 5000 eritmede towşana garşy IgG (TransGen, # HS101-01), syçanjyga garşy IgG (TransGen, # HS201-01) degişlidir.
BRD4-iň SFPQ bilen özara täsirleşýändigini ýa-da ýokdugyny has giňişleýin öwrenmek üçin HEK293T we BRD4-miniSOG öýjüklerini aşa aşa gysýan HEK293T 10 sm gaplarda gaplandy.Öýjükler sowuk PBS bilen ýuwuldy we 1 ° Pirs IP liz buferinde (Termo Fişer, # 87787) EDTA-da proteaz inhibitory bilen 4 ° C-de 30 minutlap lizelendi.Şondan soň lizatlar 1,5 ml sentrifuga turbalarynda ýygnalyp, 4 ° C-de 10 minut üçin 15,871 xg sentrifugasiýa edildi.Adatdan daşary tebigat 4 ° C-den bir gije 5 µg anti-V5 belgili syçanjygyň monoklonal antikor (CST, # 80076) bilen inkubasiýa edildi.Takmynan 50 µl belok A / G magnitli monjuklary (MCE, # HY-K0202) 0,5% Tween-20 bolan PBS bilen iki gezek ýuwuň.Soňra öýjük lizatlary 4 ° C-den aşakdan ýokara aýlanmak bilen 4 sagatlap magnit monjuklar bilen inkubasiýa edildi.Soňra monjuklar 1 ml PBST buferi bilen dört gezek ýuwuldy we 95 ° C-de 5 minut gaýnadyldy.Nusgalar SDS-PAGE jellerinde derňelip, adaty günbatar blot usullaryny ulanyp PVDF membranalaryna geçirildi.Membranalar TBST-de 5% süýtli süýtde petiklenip, başlangyç we ikinji derejeli antikorlar bilen yzygiderli inkubasiýa edildi.Ilkinji antikor towşany anti-SFPQ monoklonal antikor (CST, # 71992) TBST-de 5% süýtli süýtde 1: 1000 nisbatynda ulanyldy we bir gije 4 ° C inkubasiýa edildi.Towşana garşy IgG 1: 5000 nisbatynda ulanyldy we otag temperaturasynda 1 sagat inkubasiýa edildi.Membranalar Chemidoc MP şekillendiriş ulgamyny ulanyp, himiluminesensiýa arkaly şekillendirildi.
Solvent elýeterli ýerüsti meýdan (SASA) derňewi üçin ulanylýan ähli gurluşlar, belok maglumatlar bankyndan (PDB) 52 ýa-da AlphaFold belok gurluşy maglumat bazasy53-den alyndy.“FreeSASA” programmasyny ulanyp, her bir galyndy üçin mutlak SASA hasaplandy.Her gurluş üçin ortaça SASA almak üçin diňe gistidin we onuň goňşulary üçin doly we birmeňzeş SASA maglumatlary ulanyldy.Her gistidin üçin degişlilikde çözüjiniň elýeterliligi (RSA), mutlak SASA bahasyny erginçiniň elýeterli mümkin bolan galyndy üstki meýdanyna bölmek arkaly hasaplandy.Soňra ähli histidinler ortaça RSA 20% -den pes bolsa, başgaça açylsa, gizlin toparlara bölünýärdi.
DDA re modeiminde alnan çig faýllar umumy hapalaýjy maddalary öz içine alýan degişli SwissProt tassyklanan belok bazasynda Proteome Discoverer (v2.5) ýa-da MSfragger (Fragpipe v15.0) ulanylyp gözlenildi.Peptidler iki sany ýitip gidýän ýer bilen doly tripsini, kesgitli üýtgetme hökmünde karbamoyl metilizasiýasyny we dinamiki üýtgetme hökmünde metioniniň okislenmegini talap edýär.Öňünden gelýän we bölek agramyna çydamlylyk degişlilikde 10 ppm we 0.02 Da (MS2 Orbitrap) düzüldi. Hapalaýjy hitler aýryldy we <1% ýalňyş tapyş derejesini almak üçin beloklar süzüldi. Hapalaýjy hitler aýryldy we <1% ýalňyş tapyş derejesini almak üçin beloklar süzüldi. Попадания загрязняющих веществ были удалены, белки отфиль чвваня, ч чы получить коэффентент ложного обнаружения <1%. Hapalaýjy hitler aýryldy we <1% ýalňyş kesgitlemek derejesini bermek üçin beloklar süzüldi.去除 污染物 命中 ， 1 1 <1% 的 错误 发现。。 <1% 的 错误 发现。。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфиль кваня для достижения оровня ложных обнаружений <1%. Hapalanan hitler aýryldy we <1% ýalňyş polo positiveitel derejä ýetmek üçin beloklar süzüldi.Etiketkalary ulanmazdan mukdar taýdan derňew üçin üç sany biologiki gaýtalanyşdan kadalaşdyrylan belok mukdary ulanyldy.Beloklaryň öýjükli lokalizasiýa derňewi, DAVID Bioinformatika Resurslaryndan, MitoCarta 3.0 we Alice Ting topary tarapyndan düzülen we neşir edilen maglumatlar bazalaryndan Gen Ontologiýasy (GO) derňewi arkaly geçirildi.Wulkan kartasy Perseusdan alyndy (v1.6.15.0). Beloklaryň köp mukdarda üýtgemegi statistiki ähmiýeti üçin iki taraplaýyn t-synagdan peýdalanyldy we beloklaryň urulmagy bolçulygyň üýtgemegi> 2 (başgaça aýdylmadyk bolsa) we p bahasy <0.05 bilen kesgitlenildi. Beloklaryň köp mukdarda üýtgemegi statistiki ähmiýeti üçin iki taraplaýyn t-synagdan peýdalanyldy we beloklaryň urulmagy bolçulygyň üýtgemegi> 2 (başgaça aýdylmadyk bolsa) we p bahasy <0.05 bilen kesgitlenildi. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием дву чононнего t-критерия, и совпадения белков были идентифицирован с изменением содержя> 2 Beloklaryň mazmunynyň üýtgemegi iki guýrukly synagdan peýdalanyp, statistik ähmiýete eýe bolup, mazmunyň üýtgemegi> 2 (başgaça bellenilmedik bolsa) we bahasy <0.05 bilen kesgitlenildi.使用 双边 t 检验 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 2 2 0.05 2 0.05 0.05 2 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05使用 双边 t 检验 0.05 0.05 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0.05 0.05 2 2 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием дву зононнего т-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания> 2 (если не укачо ино). Belok düzümindäki ep-esli üýtgemeleriň statistik ähmiýeti iki guýrukly synag arkaly synag edildi we mazmunyň üýtgemegi> 2 (başgaça görkezilmedik bolsa) we p-bahalar <0.05 kesgitlenildi.Beloklaryň täsiri derňewi, String maglumatlar bazasy bilen bilelikde GO derňewi arkaly geçirildi.
Üç sany biologiki köpeltmek şuňa meňzeş netijeler bilen geçirildi.Statistik derňew GraphPad Prism (GraphPad programma üpjünçiligi) bilen geçirildi we Perseus (w1.6.15.0) bilen wulkan ýerleri döredildi.Iki topary deňeşdirmek üçin p-bahalar iki guýrukly T-synagyndan peýdalanyp kesgitlenildi.Synag toparynda azyndan iki gezek kesgitlenen ýeke-täk beloklar wulkan meýdançalaryna girizildi we p-bahany hasaplamak üçin dolandyryş toparyndaky degişli ýiten bahalar adaty paýlanyşdan Perseus bilen çalşyryldy.Roralňyşlyklar çyzgylary ortaça ± standart gyşarmany aňladýar.Statistik derňew üçin proteomiki derňewlerde azyndan iki biologiki köpeltmekde ýüze çykan beloklaryň köplügi saklandy.Mysal ölçegini öňünden kesgitlemek üçin statistik usullar ulanylmady.Synaglar tötänleýin däl.Gözlegçiler synag we netijelere baha bermek döwründe berlen meselelere göz ýummadylar.
Okuw dizaýny barada has giňişleýin maglumat üçin bu makala bilen baglanyşykly Tebigat gözleg hasabatyna serediň.
Bu gözlegde alnan köpçülikleýin spektrometriýa maglumatlary, PomeD034811 (PDPL-MS maglumat bazasy) maglumat bazasy astyndaky iProX57 hyzmatdaş ammary arkaly ProteomeXchange konsorsiumyna iberildi.Çig maglumatlar çig mal faýllary görnüşinde berilýär.Bu makala asyl maglumatlary berýär.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Daş-töweregi tanamak: belok toplumlaryny we karta organellerini häsiýetlendirmek üçin ýakynlyga bagly biotinilýasiýa ulanmak. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Daş-töweregi tanamak: belok toplumlaryny we karta organellerini häsiýetlendirmek üçin ýakynlyga bagly biotinilýasiýa ulanmak.Gingras, AS, Abe, KT we Raut, B. Daş-töwerek bilen tanyşlyk: belok toplumlaryny we karta organellerini häsiýetlendirmek üçin ýakynlyga bagly biotinilýasiýa ulanmak. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解 邻里 ： 使用。。。。。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Daş-töwerege düşünmek: goňşularyň biologiki durmuşa garaşlylygyny ulanyň.Gingras, AS, Abe, KT we Raut, B. inakynlyga düşünmek: belok toplumlarynyň häsiýetnamasy we ýakynlyga bagly biotinilýasiýa arkaly organellleriň kartasy.Häzirki.Meniň pikirimçe.Himiki.biologiýa 48, 44–54 (2019).
Geri, JB we ş.m.Dexter energiýasyny immun öýjüklerine geçirmek arkaly mikro-gurşawy kartalaşdyrmak.Ylym 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL we ş.m.Iki proteomly masştablaýyn torlar, adamyň interaktomynyň öýjüklere mahsus täzelenişini kesgitleýär.184, 3022–3040.e3028 (2021) öýjükleri.