Habarlar

Nature.com-a gireniňiz üçin sag boluň.Ulanylýan brauzer wersiýaňyzyň çäkli CSS goldawy bar.Iň oňat tejribe üçin täzelenen brauzeri ulanmagy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gabat geliş tertibini öçüriň).Şol aralykda, dowamly goldawy üpjün etmek üçin sahypany stil we JavaScript bolmazdan hödürläris.
Rak öýjükleri öýjükli stresleri ýeňip geçmek we ösüşi dowam etdirmek üçin dürli mehanizmleri döretdiler.Belok kinaz R (PKR) we onuň belok işjeňleşdirijisi (PACT), öýjükleriň köpelmegine we apoptozyň öňüni alýan dürli stres signallaryna gözegçilik edýän ilkinji jogap berijilerdir.Şeýle-de bolsa, rak öýjüklerinde PACT-PKR ýolunyň kadalaşdyrylyşy entek belli däl.Bu ýerde uzyn kodlaşdyrylmadyk RNK (lncRNA) aspartil tRNA sintetaza antisense RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR ýolunyň päsgelçiligine gönüden-göni gatnaşýandygyny we rak keseliniň köpelmegine kömek edýändigini gördük.CRISPRi 971 rak bilen baglanyşykly lncRNA-nyň uly göwrümli funksional barlagyny ulanyp, DARS-AS1-iň düwnük öýjükleriniň köpelmegi bilen baglanyşyklydygyny gördük.Şonuň üçin DARS-AS1 nokauty öýjükleriň köpelmegini bökdeýär we dürli düwnük öýjük setirlerinde düwnük öýjükleriniň apoptozyny öňe sürýär we wivo-de çişiň ösüşini ep-esli azaldar.Mehaniki taýdan, DARS-AS1 gönüden-göni PACT işjeňleşdirme domeni bilen baglanyşýar we PACT-PKR täsiriniň öňüni alýar we şeýlelik bilen PKR işjeňleşmesini, eIF2α fosforilýasiýasyny peseldýär we apoptotik öýjügiň ölümini saklaýar.Kliniki taýdan DARS-AS1 köp sanly rak keselinde giňden ýüze çykýar we bu lncRNA-nyň aşa aşa gysylmagy çaklamanyň pesdigini görkezýär.Bu gözleg, DARS-AS1 lncRNA tarapyndan PACT-PKR ýolunyň düwnük keselini kesgitleýär we rak keselini çaklamak we bejermek üçin başga bir maksat döredýär.
Stresse uýgunlaşmak ukyby, düwnük öýjüginiň ýaşamagynyň we köpelmeginiň möhüm aýratynlygydyr.Öýjükleriň ölümine signal berýän ýollary döredip bilýän, mikro-gurşawda - ýokumly iýmit ýetmezçiligi, gipoksiýa we pes pH-de düwnük keseliniň çalt köpelmegi we metabolik alamatlary.P535, 6, 7, KRAS8, 9 we HIF-110, 11, 12, 13 ýaly streslere duýgur genleriň tertipleşdirilmegi düwnük keselinde ýygy-ýygydan ýüze çykýar we şeýlelik bilen apoptozyň öňüni alýar we diri galmagyna kömek edýär.
Belok kinaz R (PKR), öýjükli stresiň öýjügiň ölümi bilen baglanyşdyrýan terjime ediji, eukariotik başlangyç faktory 2α (eIF2α) -iň möhüm stres datçigi we subunit kinazydyr.PKR ilkibaşda daşary ýurtly iki hatar RNK (dsRNA) tapylmagy bilen wirusa garşy belok hökmünde kesgitlenildi.Işjeňleşdirilenden soň, wirus we öýjükli belok sintezini saklamak üçin PKR fosforilleri eIF2α14,15,16.PACT (PKR işjeňleşdiriji belok) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 ýok mahaly ilkinji PKR işjeňleşdiriji belok hökmünde kesgitlenildi.PKR bilen gönüden-göni täsirleşmek arkaly, PACT dürli stresleri (serum açlygy, peroksid ýa-da arsenit bejergisi) PKR we aşaky signalizasiýa ýollaryna geçirýär.EIF2α fosforilasiýadan başga-da, PACT-töwekgelçilikli PKR işjeňleşdirilmegi, PI3K / Akt24 ýolunyň üsti bilen üýtgedilen redoks ýagdaýyny, p5325,26 we NF-κB27,28 üsti bilen DNK zeperlenmesini barlamak ýaly stres täsiri bilen baglanyşykly dürli hadysalary döredýär. Stresse garşy göreşde, köpelmekde, apoptozda we beýleki öýjükli proseslerde möhüm rol oýnaýandyklaryny göz öňünde tutup, PKR we PACT köp keseller, esasanam rak keseli 30,31,32,33 üçin bejeriş maksatlaryny wada berýär.Şeýle-de bolsa, bu pleiotropiki funksional we biologiki ähmiýete garamazdan, rak öýjüklerinde PACT / PKR işjeňligini kadalaşdyrmak kyn.
lncRNA-lar, belok kodlamak mümkinçiligi bolmadyk 200 nukleotidden uly ýazgydyr.Genom yzygiderliliginiň iň soňky taslamalary müňlerçe lncRNA-lary kesgitlänsoň, biologiki funksiýalaryny düşündirmek üçin 35,36 köp tagalla edildi.Ösýän gözleg topary, lncRNA-laryň köp biologiki proseslere gatnaşýandygyny görkezdi, şol sanda X-hromosomyň hereketsizleşdirilmegini kadalaşdyrmak 38,39, yz goýmak 40, transkripsiýa 41,42, terjime 43 we hatda rak keseliniň ösüşi44,45,46,47.Bu gözlegler, köp lncRNA-laryň PACT / PKR ýoluna gatnaşýandygyny habar berdi.Şeýle gözlegleriň biri, lncRNA ASPACT-iň PACT transkripsiýasyny saklaýandygyny we PACT mRNA-nyň ýadro saklanyşyny ýokarlandyrandygyny görkezdi.Beýleki gözlegler, lncRNA nc886-nyň PKR bilen baglanyşýandygyny we fosforilýasiýasynyň öňüni alýandygyny görkezdi 49,50.Şu wagta çenli PACT-töwekgelçilikli PKR işjeňleşdirmesini kadalaşdyrýan lncRNA habar berilmedi.
Aspartil-tRNA sintetaza antisense RNA 1 (DARS-AS1) onkogen lncRNA51,52,53,54 hökmünde kesgitlenildi.MiP-194-5p53, miP-12952 we miP-532-3p51 kadalaşdyrmak arkaly, DARS-AS1 degişlilikde öýjükli böwrek öýjük karsinomasynyň, tiroid karsinomasynyň we kiçi öýjükli öýken karsinomasynyň ösmegine kömek edýändigi görkezildi.Tong we kärdeşleri, şeýle hem DARS-AS1, 39 belok (RBM39) RNK bilen baglanyşdyryjy motiwiň durnuklylygyny saklamak arkaly miýelomanyň ösüşine kömek edýändigini anykladylar.Şeýle-de bolsa, bu lncRNA-nyň PACT-PKR işjeňleşdirmesini kadalaşdyrmak we rak öýjükleriniň stres täsirine degişlidigi barada hiç hili gözleg geçirilmedi.
Bu ýerde, CRISPRi ulgamyny ulanyp, uly göwrümli ýitirilen ekrany ýerine ýetirdik we DARS-AS1 lncRNA-nyň birnäçe görnüşli rak öýjükleriniň köpelmegine kömek edýändigini kesgitledik.Mundan başga-da, esasy mehanizmi kesgitledik: DARS-AS1 gönüden-göni PACT bilen baglanyşýar, PACT we PKR baglanyşygyny saklaýar, aşaky PKR substraty eIF2α fosforilýasiýasynyň öňüni alýar we ahyrynda apoptotik öýjük ölümini saklaýar.Sözümiziň ahyrynda, işimiz DARS-AS1 lncRNA-ny PACT-PKR ýoluny sazlaýjy we rak keselini bejermek we çaklamak üçin ähtimal maksat hökmünde açýar.
Giňişleýin genom profilli gözlegler, düwnük keseli bilen baglanyşykly ýüzlerçe lncRNA-ny kesgitledi.Şeýle-de bolsa, olaryň funksiýasy belli däl.Rak keseliniň ösmegine gatnaşýan geljegi uly lncRNA dalaşgärlerini kesgitlemek üçin, CRISPRi ulgamyny ulanyp, SW620 kolorektal rak keseli öýjüginde ýaýramagynyň azalmagy üçin funksiýany ýitirýän ekrany ýerine ýetirdik (1a surat).SW480 we SW620 içegäniň düwnük öýjükleriniň özboluşly aýratynlygy, olaryň bir hassadaky başlangyç we ikinji derejeli çişlerden emele gelmegidir.Bu ösen içegäniň düwnük keseliniň genetiki üýtgemelerini öwrenmek üçin gymmatly deňeşdirme berýär.Şol sebäpden, RNK yzygiderliligini ulanyp, kolorektal rak keseli öýjükleriniň (SW480 we SW620) transkriptomlaryny seljerip, neşir edilen edebiýatdan käbir funksional lncRNA-lary ýygnadyk.Bu netijelere esaslanyp, negatiw gözegçilik üçin 971 rak bilen baglanyşykly lncRNA-ny nyşana alýan 7355 sgRNA oligosyny öz içine alýan sgRNA kitaphanasyny taýýarladyk (Goşmaça maglumatlar 1).
CRISPRi ulgamyny ulanyp, barlagyň shematiki görnüşi.b sgRNA barlagdan soň baýlaşdyrmak.Gorizontal nokat çyzyk log2 (bukjanyň üýtgemegi) = ± 0.58 aňladýar.Dik nokat çyzyk p bahasyny = 0.05 görkezýär.Gara nokatlar nyşana alynmaýan sgRNA-ny aňladýar (NC diýilýär).Gyzyl nokatlar DARS-AS1 nyşana alýan sgRNA-lardyr.Gök nokatlar, öň beýan edilen onkogen lncRNA LINC00205 nyşana alýan sgRNA-lardyr.bukjanyň üýtgemegi = (kadalaşdyrylan okamak, 17-nji gün) / (kadalaşdyrylan okamak, 0-njy gün).c DARS-AS1 sgRNA urulmagy öýjükleriň ösmegini saklady.Roralňyşlyklar çyzgylary üç synagyň standart gyşarmagyny aňladýar.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 iki guýrukly Talyp synagy.d Ösümliklerde DARS-AS1 aňlatmasy (TCGA maglumat toplumy).em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP we COAD hassalarynyň jübütlenen adaty we çiş nusgalarynda DARS-AS1-iň beýany (TCGA maglumat toplumy).p-bahalar jübütlenen iki guýrukly T-synagyndan peýdalanyp alyndy.
Plazmidi gurup, mekgejöweni gaplandan soň, dört sany garaşsyz ýokaşma synagynda dCas9-SW620 kolorektal rak keseli öýjügini ýokardaky kitaphana bilen geçirdik.Bu ýokançlyklar üçin ýokançlygyň (MOI) 0,1–0.3 bolup, her öýjügiň diňe bir sgRNA bilen ýokaşyp biljekdigini görkezýär.18 günlük vitro medeniýetinden soň, maksatly sgRNA-lary baýlaşdyrmak tertibi barlagdan soň azaldy ýa-da köpeldi, nyşana alynmadyk gözegçilik oligonukleotidleriniň sany, deslapky profil bilen deňeşdirilende üýtgemedi, bu bolsa maksadymyzyň ekrana mahsusdygyny görkezýär. kitaphanasy.Tüwi.1b we goşmaça tablisa 1). Öň öýken rakyny we bagyr keseliniň ösüşini öňe sürýän LINC00205, bu barlagyň ygtybarlylygyny tassyklaýan (log2 (bukja çalşygy) <−0.58, p bahasy <0.05) barlandy (1b surat). Öň öýken rakyny we bagyr keseliniň ösüşini öňe sürýän LINC00205, bu barlagyň ygtybarlylygyny tassyklaýan (log2 (bukja çalşygy) <−0.58, p bahasy <0.05) barlandy (1b surat). " 1b). Öň öýken rakynyň we bagyr rakynyň ösüşini öňe sürmek üçin habar berlen LINC00205, bu barlagyň berkligini tassyklaýan (log2 (bukjanyň üýtgemegi) <-0.58, p-bahasy <0.05) aýryldy (1-nji surat) . LINC00205 之前 被 报道 进展, 5 58,59,60 ， （（（log2 （倍数-<-0.58 ， p 值 <0.05） ， 0.05 b b 1b）。 LINC00205 之前 被 报道 进展, 5 58,59,60 ， （（（log2 （倍数-<-0.58 ， p 值 <0.05） ， 0.05 b b 1b）。 LINC00205; 1b). Öň öýken we bagyr keseliniň ösüşini öňe sürýän LINC00205, bu barlagyň berkligini tassyklaýan (log2 (bukjanyň üýtgemegi) <-0.58, p-bahasy <0.05) aýryldy (1-nji surat).
Synag edilen ähli lncRNA-laryň arasynda DARS-AS1 hem barlandy, üç günlük sgRNA oligonukleotid 18 günlük medeniýetden soň ep-esli azaldy we bu lncRNA-nyň ýykylmagynyň rak keseliniň köpelmegine sebäp bolandygyny görkezýär (1b surat).Bu netije, kolorektal rak öýjüklerinde MTS derňewi bilen goldanyldy, DARS-AS1 urulýan öýjükleriň ösüş depgininiň gözegçilik öýjükleri bilen deňeşdirilende diňe iki esse azalandygyny we beýleki birnäçe rak keseliniň öňki habarlaryna laýyk gelýändigini görkezdi.: öýjük böwrek rak, tiroid rak we öýjük däl öýken rakyny arassalamak 51,52,53,55.Şeýle-de bolsa, kolorektal rak keselindäki funksiýasy we molekulýar mehanizmleri öwrenilmän galýar.Şonuň üçin has giňişleýin öwrenmek üçin bu lncRNA-ny saýladyk.
Näsaglarda DARS-AS1 aňlatmasyny öwrenmek üçin, “Cancer Genome Atlas” (TCGA) taslamasyndan 10,327 sany çiş nusgasyny giňişleýin seljerdik.Netijelerimiz, DARS-AS1-iň içegäniň adenokarsinoma (COAD), böwrek arassa öýjük karsinomasy (KIRC) we böwrek papilýar öýjük karsinomasy (KIRP) ýaly dürli çişlerde sagdyn öýjüklerde giňden beýan edilendigini we ep-esli tertipleşdirilendigini görkezýär..Örän az (1-nji surat we goşmaça surat 1a, b). Jübütlenen sagdyn / çiş nusgalarynyň seljermesi, öt haltasynyň karsinomasynyň (BLCA), böwrek böwreginiň arassa öýjük karsinomasynyň (KIRC), prostat adenokarsinomasynyň (PRAD), öýken skamous öýjük karsinomasynyň (LUSC) çişlerinde DARS-AS1-iň has ýokary görkezilmegini tassyklady. , ýatgy korpus endometrial karsinoma (UCEC), öýken adenokarsinoma (LUAD), bagyr gepatosellüler karsinoma (LIHC), böwrek böwrek papilýar öýjük karsinomasy (KIRP) we içegäniň adenokarsinoma (COAD) (p bahasy <0.05) (1e - m). . Jübütlenen sagdyn / çiş nusgalarynyň seljermesi, öt haltasynyň karsinomasynyň (BLCA), böwrek böwreginiň arassa öýjük karsinomasynyň (KIRC), prostat adenokarsinomasynyň (PRAD), öýken skamous öýjük karsinomasynyň (LUSC) çişlerinde DARS-AS1-iň has ýokary görkezilmegini tassyklady. , ýatgy korpus endometrial karsinoma (UCEC), öýken adenokarsinoma (LUAD), bagyr gepatosellüler karsinoma (LIHC), böwrek böwrek papilýar öýjük karsinomasy (KIRP) we içegäniň adenokarsinoma (COAD) (p bahasy <0.05) (1e - m). .Jübütlenen sagdyn / çiş nusgalarynyň seljermesi, öt haltasyndaky karsinoma (BLCA), öýjük böwrek we böwrek öýjük karsinomasy (KIRC), prostat adenokarsinoma (PRAD), öýken skamous öýjükli karsinoma (LUSC) çişlerinde DARS-AS1-iň has ýokary görkezilmegini tassyklady.. m). , korpus ýatgysynyň endometrial karsinomasy, öýkeniň adenokarsinomy (LUAD), bagryň gepatosellüler karsinomasy (LIHC), böwregiň papilýar öýjük karsinomy (KIRP) we içegäniň adenokarsinomy (COAD) 0.05) (1e– m surat).AR 健康 / 肿瘤 样本 的 AR AR DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上皮 B (BLCA) 、 肾 肾 K K (KIRC) EC 着 更高 （（EC EC EC EC EC EC EC EC EC EC EC I I I I I IR IR IR IR IR IR <0.05） （e 1e-m）.配对 健康 / 肿瘤 ars ars dars-os1 在 尿路 ars p p p p p p p p p p p p p p p p rad .癌 （kirp） ad coad） （p 值 <0.05） （e 1e-m）.Sagdyn / çiş jübütlenen nusgalaryň seljermesi, DARS-AS1-iň öt haltasyndaky karsinoma (BLCA), öýjük böwrek öýjük karsinomasy (KIRC), prostat adenokarsinoma (PRAD) we öýken skamous öýjükli karsinoma (LUSC) çişlerindäki roluny hasam goldady.(kECP) -m). korpus ýatgy karsinomasynda (UCEC), öýken adenokarsinomasynda (LUAD), gepatel öýjükli karsinomda (LIHC), böwrek papilýar öýjük karsinomasynda (KIRP) we içegäniň adenokarsinomasynda (COAD) aňlatma (p bahasy <0.05) (1e -m surat).Bu netijeler bilelikde alnanda, DARS-AS1-iň dürli rak kesellerinde giňden we ýokary derejede beýan edilýändigini görkezýär.
DARS-AS1 we DARS (antisense zolagyny kodlaýan gen) şol bir promouteri paýlaşýandyklary we biri-biriniň gapdalynda ýerleşýändigi sebäpli, DARS-AS1-ni ýykmak üçin shRNA taýýarladyk, ýöne DARS däl (Goşmaça 2a surat, b we goşmaça tablisa 2) .SW620-den başga-da, shRNA urmagyň netijeliligini we işleýşini öwrenmek üçin DARS-AS1-ni ýokary derejede görkezýän beýleki üç öýjük çyzygyny ulandyk (Goşmaça tablisa 3).Netijelerimiz, işlenip düzülen üç sany SHRNA-nyň azyndan 80% DARS-AS1 urmagyň netijeliligini, DARS mRNA mukdaryna az täsir edýändigini görkezdi (Goşmaça 2c - f).Mundan başga-da, bu shRNA-lar bilen DARS-AS1 urulmagy, SW620 (49,7%) we HCT116 (27,7%), döş mäziniň öýjük liniýasy MBA-MD-231 (53,4%) kolorektal rak keseli öýjükleriniň ösmegine ep-esli päsgel berdi.) we HepG2 gepatoma öýjük çyzygy (92,7% peselmek), şeýle hem gözegçilik edilmedik sferalary emele getirmek ukyby (öýjük çyzygynyň ortaça ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% we 75,7% peselmegi) (2a surat, b).SW620-de koloniýa emele getiriş barlagynyň netijeleri, takmynan 69,6% peselmegi bilen DARS-AS1 shRNA öýjükleriň köpelmegini ep-esli derejede päsgel berdi (2-nji surat).
Dolandyryş shRNA we DARS-AS1 shRNA-nyň SW620, HCT116, MBA-MD-231 we HepG2 öýjüklerinde öýjükleriň köpelmegine (a) we sferoid emele gelmegine täsiri.c Dolandyryş shRNA we DARS-AS1 shRNA-nyň SW620 öýjüklerinde koloniýa emele gelmegine täsiri.Öýjükleriň köpelmegi (d), sferoidiň emele gelmegi (SW) we SW620 öýjükleriniň koloniýa emele gelmegi (f) DARS-AS1-ni aşa aşa gysýar.Görkezilen maglumatlar üç synagyň ortaça ± standart gyşarmasydyr.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, we *** p ≤ 0,001 iki guýrukly T-synagy.
Funksiýa ýitgileriniň üstüni ýetirmek üçin, indiki DARS-AS1-den aşa gysýan SW620 öýjüklerini döretdik (Goşmaça 2g surat).DARS-AS1 çakdanaşa gysyş öýjükleriň ösüşini (1,8 esse), SW620 öýjüklerinde koloniýanyň emele gelmegini (3,3 esse) ep-esli ýokarlandyrdy (2d - f).Bu netijäni, A549 öýjük çyzygyny görkezýän başga bir DARS-AS1 ulanyp tassykladyk.DARS-AS1 çakdanaşa gysylmagy sebäpli bu öýjükleriň köpelmegi A549 öýjüklerinde hasam göründi (Goşmaça 2-nji surat, i we goşmaça tablisa 3).Bu girdejiler we ýitgiler bilelikde alnyp barylsa, DARS-AS1 witroda düwnük öýjükleriniň köpelmegine kömek edýär.
DARS-AS1 öýjükleriň köpelmegini kadalaşdyrýan esasy mehanizmi öwrenmek üçin, belok bilen baglanyşykly potensial hyzmatdaşlaryny kesgitlemek üçin RNK çykarmak derňewini etdik.RT-qPCR netijeleri, DARS-AS1-iň takmynan 86,2% -iniň SW620 öýjükleriniň sitoplazmasynda ýerleşýändigini görkezdi (Goşmaça 3a surat).In vitro transkripsiýaly biotinilleşdirilen DARS-AS1 ýa-da pseudoRNA soňra SW620 öýjük lizatlary bilen inkubasiýa edildi, soň bolsa SDS-PAGE bölünişi.Soňky kümüş reňk, DARS-AS1 çekiş nusgalarynda aýratyn zolagyň (~ 38 kDa) ep-esli derejede baýlaşdyrylandygyny görkezdi, ýöne RNK ýa-da monjuk nusgalarynda däl (3a surat).Bu topar köpçülik spektrometri (MS) tarapyndan PKR işjeňleşdiriji belok (PACT) hökmünde kesgitlenildi we SW620, HCT116 we HepG2 öýjük setirlerinde immunoblotting bilen tassyklandy (3a surat, b).DARS we oňa degişli PACT beloklarynyň baýlaşdyrylmagy - PKR we TRBP - Günbatar blotlama (WB) tarapyndan RNK derňewi arkaly hem derňeldi.Netijeler, DARS-AS1 RNA bilen bu üç belokyň arasynda göni täsiriň ýokdugyny görkezdi (Goşmaça 3b surat).DARS-AS1 we PACT arasyndaky anyk täsir, RNK immunopripsitasiýa (RIP) derňewi bilen tassyklandy, bu DARS-AS1-iň anti-PACT antikorlarynda ep-esli baýlaşdyrylandygyny, ýöne beýleki gözegçilik RNK-larynyň däldigini görkezdi (3c surat).DARS-AS1 başga öýjükli komponentleriň ýoklugynda PACT bilen göni aragatnaşyk saklaýandygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, arassalanan PACT ulanyp, in vitro biolaýer interferometriýa (BLI) barlagy geçirildi.Biotin belgili DARS-AS1 ýa-da gödek RNA streptawidin (SA) biosensorlarynda hereketsizleşdirildi we soňra 1 μM PACT bolan kinetiki buferde saklandy.ACeri gelende aýtsak, PACT DARS-AS1 (KD bahasy ~ 26.9 nM) bilen berk baglanyşdy, ýöne RNK-ny meňzetmeli däl (3d surat).Bu netijeler bilelikde alynsa, DARS-AS1 we PACT arasynda göni täsirleşmegi we ýokary ýakynlygy görkezýär.
RNK çekiş derňewi SW620 öýjüklerinde PACT bilen täsirleşýän DARS-AS1 kesgitledi.Oveokarda, baglanyşykly beloklaryň kümüş boýagy.Pes immunoblotlar anti-PACT antikor bilen ýerine ýetirildi.b RNK çekmek derňewi HCT116 (ýokarky) we HepG2 (aşaky) öýjüklerde geçirildi.PACT baýlaşdyrmagy immunoblotting arkaly ýüze çykaryldy.cRNA immunopripsitasiýa (RIP) barlaglary görkezilen antikorlary ulanyp SW620 öýjüklerinde geçirildi.d Doly uzynlykdaky DARS-AS1 ýa-da gözegçilik RNK bilen baglaýjy egriler biolaýer interferometri (BLI) ulanylyp alyndy.RNK streptawidin biosensorynda hereketsiz galdy.Birleşmäni ölçemek üçin 1 μM PACT ulanyldy.e RNK çekiş barlagy biotinilleşdirilen doly uzynlykdaky DARS-AS1 ýa-da kesilen (ýokarky) ulanylyp geçirildi.PACT alýan immunoblot (aşaky).f Arassalanan baýdakly PACT biotinilleşdirilen doly uzynlykdaky DARS-AS1 bilen inkubasiýa edildi ýa-da vitro RIP barlagy üçin kesildi (e-de bolşy ýaly).Çykarylan RNK RT-qPCR tarapyndan barlandy.g PACT üçin dürli RNK bölekleriniň otnositel ýakynlygy biolaýer interferometri arkaly alyndy.Derňew üçin 100 nM RNA we 1 μM RAST ulanyldy.h In vitro RIP barlaglary arassalanan ýa-da kesilen PACT belgisi bilen ýerine ýetirildi.Çykarylan RNK RT-qPCR tarapyndan barlandy.i DARS-AS1, PACT ýa-da ikisini hem aşa gysýan SW620 öýjükleriniň ösüş depgini.j SW620 öýjüklerinde doly uzyn ýa-da kesilen DARS-AS1-iň aşa aşa gysylmagy öýjükleriň ösmegine dürli täsir etdi.k Apoptoz anti-PARP antikor bilen immunoblotting arkaly ýüze çykaryldy.l DARS-AS1 nokady, akym sitometriýasynyň görkezişi ýaly SW620 öýjükleriniň apoptozyny döredýär.Görkezilen maglumatlar üç synagyň ortaça ± standart gyşarmasydyr. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001, iki guýrukly Talyp synagy arkaly. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001, iki guýrukly Talyp synagy arkaly. * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву зононму критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 iki guýrukly T-synagy. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 检验。 * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 检验。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву зононму критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0,001, **** p <0.0001 iki guýrukly T-synagy.
Soňra PACT birleşigi üçin zerur bolan DARS-AS1 sebitini kesgitlemek üçin in vitro transkripsiýasy arkaly üç sany biotinilleşdirilen DARS-AS1 RNA böleklerini döretdik (3e surat).RNK seljermesiniň netijeleri her bölekiň PACT bilen täsirleşip bilendigini görkezdi, ýöne 3 terminaly sebit (A3 belgili 384–768 nukleotid) A1 belgili 1–384-den gowrak nukleotid görkezdi (3e surat).Şuňa meňzeş netijeler rekombinant PACT ulanyp in vitro RIP analizinde-de ýüze çykdy (3-nji surat).Bu netijelere laýyk gelýän, immobilizirlenen RNK böleklerini BLI ulanyp PACT bilen baglanyşdyrmak üçin geçirilen synaglar, PACT-nyň A3 (384–768 nt) (KD bahasy takmynan 94,6 nM) has ýokarydygyny görkezdi, beýleki sebitler bilen baglanyşyk ýok diýen ýaly.(3-nji surat)
Şeýle hem, PACT bilen baglanyşykly baglanyşyk sebitlerini gözden geçirdik.PACT üç sany funksional domeni öz içine alýar, olaryň ikisi iki hatar RNK baglanyşdyryjy domenler (dsRBD) we beloklaryň özara täsirini işjeňleşdiriji üçünji domen (bellenen D3) saklanýar.Her bir domeniň lncRNA baglanyşyk ukybyny barlamak üçin, üç domeniň hersini aýyrýan we in vitro RIP barlagyny ýerine ýetiren üç sany mutasiýa etdik.Netijelerimiz, PACT-iň üçünji domeniniň (D3) pozulmagy, beýleki iki mutasiýa bilen deňeşdirilende DARS-AS1 (bitewi PACT bilen deňeşdirilende 0,11 esse) peselmegini görkezdi (3-nji surat), goýberilendigi görkezildi D3 DARS bilen täsirleşdi.-AC1.Bu netijeler bilelikde alnanda, DARS-AS1 we PACT arasyndaky özara täsiriň, esasan, DARS-AS1 3 ′ ujy we PACT D3 domeni arkaly bolup biljekdigini görkezýär.
DARS-AS1-iň PACT aňlatmasyna we PACT-iň DARS-AS1-e täsiriniň ýokdugyny belledik (Goşmaça 3c surat).Soňra PACT urulmagynyň öýjükleriň ösüşine täsirini gözden geçirdik.DARS-AS1-den tapawutlylykda, PACT ýykylanda otnositel öýjükler 1,5–3 esse çalt ösdi (Goşmaça 3d surat).Koloniýa emele getiriş barlagynyň netijeleri, öýjükleriň PACT bilen ŞRNA bejergisinden soň 2-3 esse koloniýa döredendigini görkezdi (Goşmaça 3e surat).DARS-AS1-iň PACT arkaly öýjükleriň köpelmegini kadalaşdyrýandygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin, SW620 öýjüklerini aşa köp gysýan PACT, DARS-AS1 ýa-da ikisini hem döretdik.PACT-den aşa aşa gysylmak öýjükleriň köpelmeginiň ep-esli päsgelçiligini görkezdi (3i surat).DARS-AS1 aşa aşa gysylmak öýjükleriň köpelmegine ep-esli goldaw beren bolsa-da, DARS-AS1 we PACT öýjükleriniň aşa aşa gysylmagynyň ösüş depgininde düýpli tapawut ýokdy.Bu netijeler, PACT-yň DARS-AS1 çakdanaşa gysylmagy sebäpli ýüze çykýan köpelmegine garşy durup biljekdigini görkezýär.
DARS-AS1-iň dürli sebitlerinde dürli PACT baglanyşdyryjy ukyplary barlygy sebäpli, olaryň DARS-AS1 bölekleriniň aşa aşa gysylmagy arkaly öýjükleriň köpelmegine bolan täsirini derňedik.Beýleki iki bölek bilen deňeşdirilende, DARS-AS1 öýjükleriň köpelmegini höweslendirmek üçin iň ýokary ukyby bolan DARS-AS1-iň esasy PACT bilen baglanyşykly sebiti 3 ′ ujunda (384–768 nt) aşa gysyldy (3j-nji surat).Bu netijeler, DARS-AS1-iň baglaýjy kuwwaty bilen biologiki funksiýasynyň arasynda oňyn arabaglanyşygy görkezýär.
PACT-yň apoptotik belok19 bolandygy habar berildi.Şonuň üçin DARS-AS1-iň apoptozdaky täsirini derňedik.Garaşylyşy ýaly, DARS-AS1 urulmagy SW620 öýjüklerinde PARP bölünişigini ep-esli ýokarlandyrdy we SW620, HCT116, HepG2 we MBA-MD-231 öýjük setirlerindäki V-polo positiveitel öýjükleriň paýyny artdyrdy (3k surat).3).3f - h), DARS-AS1-iň rak öýjüklerinde anti-apoptotik täsiriniň PACT-iň apoptoz-öjükdiriji funksiýasyna tersdigini görkezýär.Bu netijeler bilelikde alnanda, DARS-AS1 onkogen funksiýasynyň mehanizminiň PACT funksiýasynyň gadagan edilmegi arkaly bolup biljekdigini görkezýär.
Soň bolsa, DARS-AS1-PACT birleşiginiň funksional netijelerini öwrendik.PACT-nyň gönüden-göni täsirleşmek arkaly PKR-i işjeňleşdirýändigi habar berildi, soň bolsa eIF2α fosforilýasiýany güýçlendirýär, terjime ýok edilmegine we apoptoz17 bolýar.Ilki bilen, DARS-AS1-iň PACT we PKR-iň öýjükli lokalizasiýasyna täsir edýändigini ýa-da ýokdugyny gözden geçirdik.Konfokal floresan mikroskopiýasy, PACT we PKR-iň ortaça Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti 0,72 bolan SW620 öýjüklerinde ýokary kolokalizasiýa edilendigini görkezdi.Bu aralykda, DARS-AS1 çakdanaşa gysyş PACT we PKR bilelikdäki lokalizasiýasyny ep-esli azaltdy (Pearson korrelýasiýa koeffisiýenti ortaça 0,61) (4a surat).DARS-AS1-iň PACT-PKR täsirini modulirläp biljekdigini ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, SW620 öýjük lizatlarynda anti-PACT antikorlary bilen bilelikde immunopripsitasiýa (co-IP) analiz etdik.PKR gözegçilik öýjüklerinde anti-PACT bilen ýokary derejede baýlaşdyryldy, DARS-AS1 öýjüklerini aşa gysýan öýjüklerden lizatlarda PKR dikelişi ep-esli azaldy (4b surat).Arassalanan bellikli PACT we PKR in vitro belogy baglanyşdyryjy barlaglar üçin ulanyldy.Şoňa laýyklykda DARS-AS1 bilen üpjün eden, ýöne hiç hili gözegçilik RNK basylan PACT-PKR täsirini görkezmedi (4c surat).Netijeleriň hemmesi DARS-AS1-iň PACT we PKR aragatnaşygyny kesendigini görkezdi.
Dolandyryş öýjüklerinde ýa-da DARS-AS1 öýjüklerinde PACT we PKR-nyň bilelikde lokalizasiýasy, konokok floresan mikroskopiýasy arkaly syn edildi.Nucadrolary DAPI bilen boýaldy.Statistik netijeler 16 suratdan alyndy.b SW620 öýjükleriniň ýa-da DARS-AS1 öýjüklerini aşa aşa gysýan öýjük lizatlarynda anti-PACT antikoryny ulanyp, bilelikde immunopripsitasiýa (bilelikde IP).c Bellikli PACT, arassalanan PKR we DARS-AS1 ýa-da masgaralaýjy RNK bilen vitro görnüşinde transkripsiýa in vitro belogyň derňewi üçin inkubasiýa edildi.Immunopripsitasiýa üçin baýdaga garşy antikorlar ulanyldy.d Görkezilen antikorlary bolan immunoblotlar SW620 we HCT116 öýjüklerinde gözegçilik shRNA ýa-da DARS-AS1-shRNA bilen ýokaşdy, soň bolsa serum açlygy bilen geçirildi.e DARS-AS1 aňlatma derejesi, öýjükli duýgurlygy tapsigargin üýtgedi.SW620 öýjükleri DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 aşa aşa gysyş plazmidi ýa-da gözegçilik plazmidi bilen ýokaşdy.Öýjükler 48 sagatlap tapsigargin bilen bejerildi we öýjükleriň ýaşaýyş ukyby MTS reagentiniň kömegi bilen kesgitlenildi.f In vitro transkripsiýa DARS-AS1 ýa-da gödek RNK we arassalanan PACT in vitro işjeňleşdirme barlagy we immunoblot tapmak üçin ulanyldy.g Bu antikorlary ulanýan immunoblotlar SW620-ctrl öýjüklerinde (çepde) ýa-da PKR mutantlaryny (sagda) aşa aşa gysýan öýjüklerde geçirildi.Soňra bu öýjükler gözegçilik shRNA ýa-da DARS-AS1-shRNA bilen ýokaşdy, soň bolsa serum açlygy.h Akym sitometriýasy mutant PKR-iň hereketsizliginiň SW620 öýjüklerinde DARS-AS1-öjükdirilen apoptozyň öwezini dolandygyny görkezdi.i Görkezilen antikorlary bolan immunoblotlar SW620 (çepde) ýa-da HCT116 (sag) öýjüklerde geçirildi.Dolandyryş shRNA ýa-da DARS-AS1 shRNA bilen üýtgedilen öýjükler serumdan mahrum we 100 nM PKR C16 inhibitory ýa-da DMSO bilen doldurylýar.Tereziniň çyzgysy = 5 µm.Görkezilen maglumatlar üç synagyň ortaça ± standart gyşarmasydyr.* p ≤ 0.05 iki guýrukly Talyp synagy.
Adatça, PACT PKR17 bilen täsirleşenden soň, Thr451-de PKR fosforilýasiýa sebäp bolup biler diýip hasaplanýar.Netijelerimiz, serum açlygyndan soň DARS-AS1 urulýan öýjüklerde PKR fosforilýasiýa derejesiniň ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi (4d surat we goşmaça 4a surat).Şoňa laýyklykda esasy PKR substraty bolan eIF2α fosforilýasiýasynyň DARS-AS1 shRNA (4d surat we goşmaça 4a surat) bilen ep-esli ýokarlanandygyny gördük.Thapsigargin, ER-iň Ca2 + çykmagyna sebäp bolýan ER stresidir.Tapsigargin bilen bejerginiň, PKR bilen has täsirli we işjeňleşýän PACT-iň aňlatmagyna we işjeňleşmegine itergi berýändigi, eIF2α fosforilýasiýanyň 18,61 köpelmegi bilen apoptoza sebäp bolýandygy habar berildi.Bu ýerde, DARS-AS1 öýjükleriň PACT / PKR ýoluny saklap, stresleri ýeňip geçip biljekdigini barlamak üçin PACT / PKR ýoluny gyjyndyryjy hökmünde tapsigargin ulandyk.DARS-AS1 aňlatmasynyň derejesiniň öýjükleriň tapsigargin garşylygy bilen oňyn arabaglanyşygyny gördük.SW620 öýjükleri çakdanaşa gysýan DARS-AS1, tapsigargin bilen bejerilende has gowy ýaşapdyr, DARS-AS1 ýykylan öýjükler has duýgur bolýar (4e surat).Bu netijelere laýyk gelýän DARS-AS1 çakdanaşa gysyş, tapsigargin bilen örtülen PKR fosforilýasiýasyny azaltdy (Goşmaça 4b surat).Munuň tersine, tapsigargin bejergisinden soň, PKR we eIF2α gözegçilik öýjükleri bilen deňeşdirilende DARS-AS1 urulýan öýjüklerde has ýokary derejede fosforirlendi (Goşmaça 4b surat).Gyzykly tarapy, Tapsigargin, DARS-AS1-iň streslere garşy funksiýasyny görkezip biljek dozada garaşly görnüşde DARS-AS1 aňlatmasyny döretdi (Goşmaça 4c surat).Mundan başga-da, bu gözegçilikleri tassyklamak üçin in vitro işjeňleşdirme barlaglaryny etdik.Gysgaça aýdylanda, PKR anti-PKR antikoryny ulanyp, öýjük lizatlaryndan arassalandy, soňra vitroda ýazylan rekombinant PACT we DARS-AS1 bilen inkubasiýa edildi.Enzimatiki reaksiýadan soň fosho-PKR WB ulanyp tapyldy.Netijelerimiz, PKR fosforilýasiýasynyň DARS-AS1 tarapyndan ep-esli derejede saklanandygyny, ýöne gözegçilik RNK tarapyndan däl-de (4f surat) görkezdi.Bu in vitro we in vivo netijeleri, DARS-AS1-iň PACT-töwekgelçilikli PKR işjeňleşmesini saklaýandygyny görkezýär.Şol bir wagtyň özünde, DARS-AS1 bolan ýagdaýynda PACT dikelişiniň azalandygyny hem gördük (4f surat).Bu netije in vitro belogy baglaýjy barlagyň (4c surat) netijelerine laýyk gelýär we PACT-PKR birleşmesi üçin DARS-AS1-iň blokirleme funksiýasyny ýene bir gezek görkezýär.
Öýjükli stresde PKR işjeňleşdirilmegi üçin PACT D3 domenindäki Ser246 we Ser287 zerur.Iki sany serin galyndysyny alanine çalyşmak mutant PACT (mutD) berdi, bu stres ýok wagtynda PKR-ni işjeňleşdirdi we alaniniň (mutA) çalyşmagy protokoly tersleşdirdi.Bu domeniň DARS-AS1 bilen gönüden-göni baglanyşykda ähmiýetini görkezendigimiz sebäpli, bu galyndylaryň DARS-AS1 bilen täsirleşip biljekdigini ýa-da ýokdugyny barlamak üçin bu iki PACT mutantyny döretdik.Gyzykly tarapy, mutantlaryň ikisi-de DARS-AS1 bilen täsirleşmek üçin PACT belogynyň doly gurluşynyň zerur bolup biljekdigini görkezýän DARS-AS1 (Goşmaça 4d surat) baglanyşyk ukybyny ýitirdi.
Mundan başga-da, netijelerimiz, öýjükleriň köpelmeginiň DARS-AS1-shRNA bilen örtülen inhibisiýasynyň agdyklyk edýän negatiw PACT mutantyny (PACTmutA) ýa-da agalyk ediji negatiw PKR mutantyny (PKRmut) aşa aşa gysmak arkaly bölekleýin dikeldilip bilinjekdigini görkezýär (4-nji surat. E).Dominant-negatiw PKR mutantlarynyň çakdanaşa gysylmagy DARS-AS1 urulmagy netijesinde ýüze çykan PKR fosforilýasiýasyny, şeýle hem serumdan mahrum öýjüklerde eIF2α fosforilýasiýany peseltdi (4g surat).Has möhümi, PKRmut (4-nji surat we goşmaça 4g surat) öýjüklerinde DARS-AS1 urulmagy netijesinde dörän apoptotik öýjükleriň paýy azaldy.PKR kinase işjeňliginiň gadagan edilmegi DARS-AS1 funksiýasyna hem zyýan ýetirýär, sebäbi netijeler PKR-e mahsus C16 inhibitory bilen bejerilende DARS-AS1 urulmagynyň PKR we eIF2α fosforilýasiýa seýrek sebäp bolandygyny görkezdi (4i surat we goşmaça surat 4h).).Netijelerimiz bilelikde alnanda, DARS-AS1-iň, PACT-araçylyk PKR işjeňleşmesini saklap, öýjükleriň köpelmegine kömek edýändigini görkezýär.
DumS-AS1-iň tumorigenezdäki roluny has giňişleýin öwrenmek üçin syçanjygyň ksenograft modelini ulanyp, wivo synaglarynda geçirdik. Netijeler, DARS-AS1-iň urulmagy syçanlarda çişiň ösüşiniň ep-esli azalandygyny görkezýär (p bahasy <0.0001) (5a surat). Netijeler, DARS-AS1-iň urulmagy syçanlarda çişiň ösüşiniň ep-esli azalandygyny görkezýär (p bahasy <0.0001) (5a surat). Результатя показывают, что ададаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мшей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Netijeler, DARS-AS1 urulmagynyň syçanlarda çişiň ösüşini düýpgöter azaldýandygyny görkezýär (p bahasy <0.0001) (5a surat).AR 表明 AR DARS-AS1 0. 敲 0. 0. 0. 0. <0.0001） （5a）AR 表明 AR DARS-AS1 0. 敲 0. 0. 0. 0. <0.0001） （5a） Результатя показали, что Кададаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мшей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Netijeler, DARS-AS1 urulmagynyň syçanlarda çişiň ösüşini ep-esli peseldendigini görkezdi (p bahasy <0.0001) (5a surat).Şeýlelik bilen, DARS-AS1 urulýan toparda orta çiş mukdary takmynan 72,9%, orta çiş massasy takmynan 87,8% azaldy (5b-d surat).Bu netijeler, DARS-AS1-iň “vivo” -de çişiň ösmegine ep-esli derejede kömek edip biljekdigini görkezýär.
DARS-AS1 mahabatynyň ýalaňaç syçanlarda kolorektal onkogenezine täsiri.Ösüş egrileri (a), çişiň ululygy (b), agramy (c) we çiş şekilleri (d) görkezilýär.Roralňyşlyklar paneli ± SEM-ni görkezýär. n = 10. **** p <0.0001, iki guýrukly Talyp synagy bilen. n = 10. **** p <0.0001, iki guýrukly Talyp synagy bilen. n = 10. **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. n = 10. **** p <0.0001 iki guýrukly Talyp synagy.n = 10. **** p <0.0001 ， 通过 双 学生 学生。 **** p <0.0001 ， 通过 双 学生 学生。 **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента. **** p <0.0001 iki guýrukly T-synagy.e Kaplan-Meier, DARS-AS1 aňlatma derejeleriniň we UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM we LGG hassalarynda umumy diri galmagyň arasyndaky baglanyşygy seljerdi.Näsaglarda ýokary derejeli DARS-AS1 aňlatmasy iň ýokary 50% -de;hassalarda DARS-AS1 aňlatmasynyň pes derejesi 50% -de boldy.p-bahalar gündelik dereje synagyndan peýdalanyp kesgitlenildi.f DARS-AS1 PACT-PKR ýoluny we çişiň ösüşini kadalaşdyrýan teklip edilen model.
DARS-AS1-iň kliniki täsirine has gowy düşünmek üçin, onuň aňlatmasy bilen hassanyň diri galmagynyň arasyndaky baglanyşygy gözden geçirdik.TCGA maglumat toplumyny seljermek bilen, has ýokary DARS-AS1 aňlatmanyň uve melanoma (UVM), böwrek hromofobiýasy (KICH), böwrek papilýar öýjük karsinomasy (KIRP), mezotelioma (MESO), multiplex bilen baglanyşyklydygyny gördük.Aşaky diri galmak glioblastoma morfozy (GBM) we pes derejeli beýni gliomasy (LGG) näsaglar bilen ep-esli baglanyşyklydy (5e surat).Bu netijeler, DARS-AS1-iň kliniki çişiň ösmeginde möhüm rol oýnap biljekdigini we birnäçe düwnük keselinde çaklap boljak biomarker bolup biljekdigini görkezýär.
Bu gözlegde, uly göwrümli CRISPRi funksional barlagy ulanyp, DARS-AS1 lncRNA-nyň iki esasy stres jogap berijisi, PACT we PKR-i kadalaşdyrmak arkaly rak keseli stresini ýeňip geçýändigini kesgitledik.PACT bilen gönüden-göni täsirleşip, DARS-AS1 PACT-töwekgelçilikli PKR işjeňleşmesini saklady, şeýlelik bilen apoptotik öýjükleriň ölmeginiň öňüni aldy we öýjükleriň köpelmegine kömek etdi (5f surat).DARS-AS1-iň sazlanylyşy, düwnük keseliniň köp görnüşinde ýüze çykypdyr we bu ýagdaýyň, düwnükli şertlerde rak keseliniň ýaşamagyny ýokarlandyrmak funksiýasynyň, düwnük keseliniň köp görnüşine giňden ulanylyp bilinjekdigini görkezýär.
PACT PKR işjeňleşdiriji belok hökmünde kesgitlenildi we transkripsiýa, terjime, apoptoz we beýleki möhüm öýjükli amallary kadalaşdyrmak arkaly PACT-töwekgelçilikli PKR işjeňleşdirilmegi, stres täsirlerinde möhüm rol oýnaýar62.Onýyllyklaryň dowamynda PACT-PKR kaskadynyň düwnük keseline düşünmek üçin synanyşyklar edildi.Bu ýerde, gözlegimiz, PACT bilen gönüden-göni baglanyşýan, PACT-PKR täsirini bökdeýän, PKR işjeňleşmegini we eIF2α fosforilýasiýany saklaýan, şonuň bilen stresli apoptozyň öňüni alýan öýjükli lncRNA DARS-AS1 öýjükli rak öýjüklerinde PACT-PKR kadalaşdyrmagyň başga bir mehanizmini ýüze çykardy. ahyrky rak keseliniň köpelmegine itergi berýär.öýjükleri.Bu açyş, rak keselini çaklamak we bejermek üçin mümkin lncRNA maksatlaryny açýar.
Maglumatlarymyz, fosforirlenen PKR we eIF2α ep-esli ýokarlanmagy bilen öýjükleri serum açlygyna duýgur edýändigini görkezdi.Bu netijeler, DARS-AS1-iň PACT / PKR işjeňligini saklamak bilen agyr şertlerde rak keseliniň ýaşamagyna kömek edýändigini görkezýär.ASPACT we nc886 ýaly başga-da kodlaşdyrylmadyk birnäçe RNK, PACT48 mRNA-ny kadalaşdyrmak ýa-da PKR49,50,64 bilen baglanyşyk arkaly awtofosforilýasiýany kadalaşdyrmak arkaly PACT / PKR okuna gatnaşýar.Olaryň arasynda DARS-AS1, PACT-PKR birleşmesini bozýan hökmünde çykyş edýär.Bu gözleg, PACT / PKR okunyň kadalaşdyrylyşyna we lncRNA-laryň stres täsirlerinde roluna düşünişimizi baýlaşdyrýar.
PACT üç aýry domeni öz içine alýar.Ilkinji iki dsRBD-leriň her biri, PACT-iň PKR bilen ýakyn baglanyşygyny gazanmak üçin ýeterlikdir, üçünji domen (D3) PKR-i vitro we vivo-de işjeňleşdirmek üçin zerurdyr.Biziň gözlegimiz, DARS-AS1-iň D3 domeni bilen ileri tutýandygyny görkezdi (3-nji surat).LncRNA (768 nukleotid) ululygyny göz öňünde tutup, D3 bilen baglanyşdyrýan DARS-AS1 dsRBD we PKR domeniniň PACT domeniniň arasyndaky täsirini fiziki taýdan päsgel berip biler we şeýlelik bilen PACT we PKR birleşmesini bökdäp biler.D3-de Ser246 we Ser287-ni alanin ýa-da aspartat bilen çalyşan PACT nokat mutasiýalary, D3-iň umumy gurluş we elektrik häsiýetleriniň birleşmesindäki ähmiýetini görkezip, DARS-AS1 bilen baglanyşygyny bozdy.Geljekde has takyk biohimiki derňewi we ýokary çözgütli PACT gurluş derňewini ulanyp, bu mehanizmiň has jikme-jiklikleri zerur bolar.
Öňki barlaglar DARS-AS1-iň birnäçe mehanizm arkaly öýjükleriň köpelmegine kömek edýändigini habar berdi51,52,53.Bir mysalda, derňewçiler DARS-AS1-iň böwrek mäziniň öýjüklerinde miP-194-5p nyşana alyp, antisense belok kodlaýan DARS genini düzendigini gördüler.Şeýle-de bolsa, häzirki gözlegde, DARS-AS1 urulmagy, iň bolmanda kolorektal, döş we bagyr kesellerini öz içine alýan köp sanly rak keselinde DARS transkripsiýasyna az täsir etdi.LncRNA-lar öýjük we dokumalara mahsus aňlatma görnüşlerini görkezýändigi sebäpli, gözegçiliklerimiz bilen dürli rak kesellerine öňki baha berişlerimiziň arasyndaky bu tapawudyň döremegine sebäp bolup biljek rak keseliniň görnüşlerinde funksional mehanizmler saklanyp bilinmez.Dürli fiziologiki we patologiki prosesleriň anyk mehanizmlerini düşündirmek üçin ýörite gözlegler zerurdyr.
Kliniki maglumatlaryň seljermesi, çişlerdäki DARS-AS1 aňlatmasynyň, rak keseliniň diri galmagy bilen ters arabaglanyşygyny görkezdi, bu bolsa DARS-AS1 / PACT / PKR okunyň rak keseliniň çaklamasyndaky ähmiýetini görkezýär.Sözümiziň ahyrynda, gözlegimiz DARS-AS1-iň PACT / PKR signalizasiýa okunyň sazlaýjydygyny, rak keseliniň köpelmegine kömek edýändigini we başga bir gözleg ugry berýän we geljekki gözlegler üçin geljekki gözlegler üçin gyzyklanma döredýän stres täsiri wagtynda apoptozyň öňüni alýandygyny görkezýär. .
Adam öýjük liniýalary SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 we HEK293T Hytaýyň Milli öýjük liniýa çeşmeleriniň infrastrukturasyndan alyndy.Cellshli öýjükler 10% FBS (Gemini, Bruklin, NY) we 1% penisillin-streptomisin (Termo Fisher Scientific) bilen 37 ° C, 5% CO2 bilen doldurylan DMEM gurşawynda (DMEM, Termo Fisher Scientific, Waltham, MA) saklandy.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosho-T451), Abcam (ab81303);Baýdaga garşy, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-tubulin, CST (2128);adaty syçanjygy IgG, CST (5415S);adaty towşan IgG, CST (2729S).Antikorlar Günbatar partlamasy üçin PBST-de 1: 1000 we IP üçin 1: 100 suwuklandyryldy.
sgRNA-lar CRISPR-ERA66 atly köpçülige açyk gural arkaly işlenip düzüldi.SgRNA ösüşi üçin deslapky gural parametrlerini we 3 kb sebitindäki algoritm hasaplanan sgRNA baglanyşyk ýerlerini ulandyk.merkezleşdirilen TSS.SgRNA oligonukleotidleriň howuzlary CustomArray Inc.Jemi 12 µg birleşdirilen adamlaşdyrylan pgRNA plazmidi, 7,2 µg psPAX2 (Addgene # 12260) we 4,8 µg pMD2.G (Addgene # 12259) DNK transfeksiýa reagentini ulanyp, 10 sm gaplarda 5 x 106 HEK293T birleşdirildi. öýjükleri (CWBIO, Pekin, Hytaý) öndürijiniň görkezmesine eýerýär.Wirusy öz içine alýan adatdan daşary hadysalar transfeksiýadan 48 we 72 sagat soň ýygnalyp, 0,45 mkm süzgüç arkaly süzüldi.Barlamak üçin, wC ýokaşmagy arkaly dCas9 / KRAB birleşme belogyny aňladýan SW620 öýjükleri alyndy.Üýtgedilen SW620 öýjükleri MOI-de 0,1-0.3 derejesinde dört sany garaşsyz ýokaşma synagynda wirus kitaphanasyna ýokaşdy we 2 günüň dowamynda 2 μg / ml puromisin (Sigma, Sent-Luis, MO) bilen nusga alyndy.Ondan soň, öýjükler 18 günläp vitroda ösdürilip ýetişdirildi, iň az kitaphanada 500 öýjük / sgRNA bar.
Genomiki DNK, QIAamp DNA gan Midi toplumynyň (QIAGEN, Düsseldorf, Germaniýa; 51183) görkezmesine laýyklykda alyndy.Umuman, kitaphanany gurmak üçin biologiki gaýtalama üçin 100 μg genom DNK ulanyldy.SgRNA sebiti iki tapgyr PCR bilen güýçlendirildi we ştrih-kod bilen baglanyşdy.
PCR önümleri NucleoSpin® jeli we PCR arassalaýyş toplumy (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germaniýa; 740609.250) ulanylyp arassalandy we Qubit ™ HS iki hatar DNK kesgitleýiş toplumy (Termo Fisher Scientific; Q32854) bilen arassalandy.
MTS barlagy öýjükleriň köpelmegini ölçemek üçin ulanyldy.Öýjükler 2000 öýjük / guýynyň başlangyç dykyzlygynda 96 guýy tarelkä ekildi.Öýjükleriň otnositel mukdary görkezilen wagtda her gün jemi 4-6 gün ölçeldi.Her guýy üçin 20 μl MTS reagenti (Promega) 100 μl DMEM bilen suwuklandyryldy, 37 ° C-de 4 sagat öýjükler bilen inkubasiýa edildi, soň bolsa OD490 ölçenildi.
Düzedilmedik ösüş ukyby, sferalaryň emele gelşini seljermek arkaly ýüze çykaryldy.Gysgaça, shRNA DARS-AS1 ýa-da gözegçilik shRNA bilen ýokaşan 2000 öýjük, her 4 günden orta üýtgeşiklik bilen ultra pes birikdirilen mikroplatlarda (Corning) ösdürilip ýetişdirildi.Sferoidler 14 günden soň sanaldy.Güýçlendirmek barlagy üçin DARS-AS1 aşa aşa gysyş plazmidi ýa-da dolandyryş plazmidi bilen ýokaşan 500 öýjük ulanyldy, ýogsam bu usul üýtgemedi.
RNK, Riboprobe® kombinasiýa ulgamlarynyň (Promega P1440) görkezmesine laýyklykda T7 RNA polimeraza we biotin-16-UTP (Roche 1138908910) ulanylyp transkripsiýa edildi.Bu ýerde ulanylýan desgalar goşmaça 4-nji tablisada görkezilýär.
Belok kodlaýjy PACT ýa-da PKR sebitleri pET15b (Addgene # 73619) klonlaşdyryldy we BL21 (DE3) görnüşine öwrüldi.Bakteriýalar ampisillin bilen üpjün edilen LB-de bir gije inkubasiýa edildi, soň bolsa täze LB bilen 100 esse suwuklandy.Orta serişdäniň OD600 0.8-e ýetende, beloklaryň aňlatmagyna itergi bermek üçin 1 mM IPTG goşuldy.Bir gijede ýumşak titremeden (20 ° C-de 250 aýlaw) inkubasiýa edilenden soň, öýjük bölejigi sentrifugasiýa (4000 aýlaw, 10 minut, 4 ° C) bilen ýygnaldy.Öýjük bölejigini liz buferinde (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) gaýtadan işlediň we buzda 30 minut inkubasiýa ediň, soňra sonikat (15 minut, 5 s / buz, buzda) we sentrifuga (13,000) rpm)., 30 min, 4 ° С).Adatdan daşary tebigat Ni-NTA rezine (QIAGEN) 4 ° C-de 3 gezek ýüklendi, ýuwujy bufer bilen (50 mM Tris, pH 8.0, 40 m imidazol, 250 mM NaCl) 4 gezek ýuwuldy we jemi 3 gezek uzaldyldy 10 ml eluent buferden (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Arassalanan belok WB ulanyp kesgitlenildi we konsentrasiýasy Qubit ™ belok analiz toplumy (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) ulanylyp kesgitlenildi.
RIP barlaglary üýtgetmeler bilen öň beýan edilişi ýaly ýerine ýetirildi.Gysgaça, 1x RIP bufer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonukleýz inhibitory (Promega), PMSF (Beýotime biotehnologiýasy), 1 mM DDM, proteaz) sitostatik 1 x 107 kokteýl (Roç, 1 mM DTT) we sentrifuga 13,000 aýlawda 4 minutda 15 minutda.Adatdan daşary tebigat, 5 μg anti-PACT antikor (Abeam) ýa-da IgG (CST) bilen birleşdirilen A + G magnitli monjuklar (Millipore) bilen inkubasiýa edildi.Monjuklar 5x RIP buferi bilen 5 gezek ýuwuldy, soňra proteinase K (NEB) bilen siňdirildi.RNK Trizol bilen alyndy we RT-qPCR tarapyndan kesgitlenildi.Primerler 5-nji goşmaça tablisada getirilýär.
In vitro RIP barlagy üýtgedilen standart RIP barlag protokolyna laýyklykda geçirildi.Jemi 5 pm in vitro transkripsiýaly RNK RIP buferi bilen 1x suwuklandyryldy we 65 ° C inkubasiýa bilen 5 minutlap gyzdyryldy, soňra otag temperaturasyna haýal sowadyldy.Jemi 5 pmol üýtgemedik ýa-da üýtgedilen baýdak belgili PACT beloklary E. coli arassalandy.4 sagatda 2 sagat üýtgedilen RNK bilen inkubasiýa ediň we baýdaga garşy IP üçin RIP derňewi üçin ýokardaky prosedurany ýerine ýetiriň.
RNK giňeltmek derňewi üçin 1 × 107 öýjük 1xRIP buferi bilen lizelendi.13,000 aýlawda 4 minutda 15 minutda sentrifugadan soň, adatdan daşary tebigat 30 μl streptawidin magnit monjuklary (Bekman) bilen 4 sagatda 4 sagatda öňünden taýýarlandy.Arassalanan lizat soňra hamyrmaýa TRNA bilen üpjün edildi we 4 ° C-de bir gije 40 pmol üýtgedilen RNK bilen inkubasiýa edildi, soň ýene 2 sagat we BSA bilen bloklanan täze streptawidin magnit monjuklary goşuldy.Hinguwmak ädimi 5x RIP buferi bilen 4 gezek we 1x RIP buferi bilen 4 gezek ybaratdy.Degişli beloklar biotin elýusiýa buferi (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 m D-biotin, PMSF) bilen çykaryldy we NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) bilen bölünipdi.Kümüş reňklenenden soň (Beýotime biotehnologiýasy), käbir toparlar MS tarapyndan analiz edildi we analiz edildi.
Bilelikdäki IP derňewi, PACT bilen PKR-iň özara täsirini barlamak üçin geçirildi.Gysgaça aýdanyňda, adatdan daşary lizatlar 1 x RIP buferinde 1 x 107 lizirlenen öýjükleri inkubasiýa etmek arkaly taýýarlandy, soňra 13,000 aýlawda sentrifugasiýa 4 ° C-de 15 minut dowam etdi.Lizatlar A + G magnitli monjuklar bilen dolduryldy, 5 µg anti-PACT antikor bilen birleşdirildi we bir gije 4 ° C-de ýuwaşlyk bilen aýlandy.Monjuklar 5 × RIP buferi bilen 3 gezek, iki gezek 1 × RIP buferi bilen ýuwuldy we 1 × SDS buferi bilen uzaldyldy.Dikeldilen belok SDS-PAGE jeli bilen seljerildi we WB tarapyndan tapyldy.
Baýdakly PACT iki agşam we PKR-den 1 pmol E. coli arassalandy.1 × RIP buferinde garyşdyryň we 4 ° C-de 2 sagatlap üýtgedilen RNK bilen inkubasiýa ediň.Ondan soň, goşmaça iki sagatlap A + G magnitli monjuk-konýugirlenen anti-bellikli antikor bilen inkubasiýa edildi.Monjuklar 1x RIP buferi bilen dört gezek ýuwuldy we 1x SDS buferi bilen uzaldyldy.Alnan PACT we PKR WB tarapyndan tapyldy.